木瓜蛋白酶提取蛇皮膠原蛋白的工藝研究

吳玉瓊，駱紅霞，胡永樂，張　靜，溫愛國（.武夷學院 茶與食品學院，福建 武夷山 354300；.武夷山蛇類研究所，福建 武夷山 354300）

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木瓜蛋白酶提取蛇皮膠原蛋白的工藝研究

吳玉瓊1，駱紅霞1，胡永樂1，張靜1，溫愛國2
（1.武夷學院 茶與食品學院，福建 武夷山 354300；2.武夷山蛇類研究所，福建 武夷山 354300）

摘要：采用木瓜蛋白酶從人工養殖的蛇皮中提取膠原蛋白，研究了提取液的pH值、酶濃度、溫度、固液比和提取時間對膠原蛋白提取率的影響。結果表明，木瓜蛋白酶提取蛇皮中膠原蛋白的最佳工藝為：提取溫度30℃，提取劑檸檬酸，木瓜蛋白酶濃度3.00%、固液比1:10、pH值6、提取時間24 h，在此條件下膠原蛋白提取率為89.30%。

關鍵詞：蛇皮；膠原蛋白；木瓜蛋白酶；最佳參數

膠原蛋白是一種白色、不透明、無支鏈的纖維蛋白質，是由動物細胞合成的一種生物性高分子，廣泛存在于動物的骨、腱、肌鞘、韌帶、肌膜、軟骨和皮膚中，是結締組織中極其重要的一種蛋白質，具有重要的生物學性質和較好的力學性能，具有良好的生物相容性和可生物降解性，還具有促進細胞生長的特性[1-3]。

研究表明膠原蛋白的應用極為廣泛，主要有臨床醫學有促進細胞的損傷修復和細胞生長[4-9]，生物發酵中作為一種新型的生物發酵培養基[10]，在食品中的應用于功能性食品、肉制品改良劑、食品包裝材料等[11-13]。

膠原蛋白的提取一般集中于膠原蛋白較為豐富的組織，例如皮膚和肌腱。膠原的提取除了傳統的來源一一一牛、豬、羊，還拓展到許多其他的資源，例如人的胎盤[14]、海洋生物[15]，甚至是利用基因生物技術從轉基因動物獲取重組人膠原蛋白[16-17]。

我國蛇資源豐富，由于蛇皮外觀的花紋清晰艷麗，圖案獨特，經制革工藝處理后，用來制作各種精美別致的工藝品，或可用來制作樂器的琴膜和鼓皮。但由于蛇皮工藝技術的落后，在加工過程中，產生了大量下腳料，約占完整蛇皮的20%～30%，如果不進行有效處理，不僅污染環境，還浪費大量的原料。蛇皮中含有大量的膠原蛋白，當前，以魚鱗、各類動物皮制備的一系列膠原產品已具有廣闊的應用領域，橫跨化工業、食品行業、化妝品業、醫藥業，可見以蛇皮制備膠原的系列產品的開發也有著美好的前景。

武夷山素有“蛇的王國”之美譽，不僅因為其具有多種多樣的生態環境，為蛇的棲息、繁衍提供了適宜的條件，還因武夷山蛇類養殖產業發展廣泛，僅市區周邊的蛇類養殖戶就有數十家，養殖基地面積達300 m2。據調查，本地每年產蛇量可達100 t，其中10%為蛇皮，用于工藝品加工后被廢棄的副產物達3%，可見綜合開發利用武夷山菜蛇資源是促進蛇類養殖業長足發展的趨勢。

本文采用木瓜蛋白酶，以武夷山人工養殖的王錦蛇（Elaphe carinata）、赤鏈蛇（Dinodon rufozonatum）等蛇皮為原料，探討了蛇皮中膠原蛋白的提取工藝，確定了酶法從蛇皮工藝下腳料中提取膠原蛋白的最佳工藝條件，以制備高附加值、市場前景廣闊的膠原蛋白，從而變廢為寶，實現廢物利用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1主要材料

蛇皮：由武夷山蛇博園提供。

1.1.2主要試劑

木瓜蛋白酶（上海沃凱藥業有限公司）

L-羥脯氨酸（上海沃凱藥業有限公司）

對二甲氨基苯甲醛（Sigma公司）

氯胺T（國藥集團化學試劑有限公司）

1.1.3主要儀器

UV-1800型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）

FW100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）

TG16K-Ⅱ高速離心機 （長沙東旺實驗儀器有限公司）

1.2試驗方法

1.2.1蛇皮預處理

蛇皮分離→色素等可溶性雜質的去除→烘干→破碎→脂肪去除→雜蛋白去除→烘干

1.2.2操作要點

（1）分離

對蛇皮的處理需將蛇肉與蛇皮徹底分開，避免蛇肉蛋白影響結果。

（2）色素等可溶性雜質的去除

使用質量分數為10%的Na2CO3溶液清洗蛇皮，去除色素等可溶性雜質，再以清水洗滌至pH為中性[18]。

（3）破碎

剪切成約0.5cm×0.5 cm的碎片，30℃烘干，用高速組織搗碎機搗碎。

（4）脂肪的去除

取上述處理過的碎蛇皮，按1∶20（體積質量比）用1:1無水乙醚+石油醚浸泡0.5 h，振蕩處理2 h[19]。6 000 r/min離心15 min，去上清液，得沉淀，置于通風處讓無水乙醚和石油醚揮發，晾干，待用。

（5）雜蛋白的去除

取上述處理過的蛇皮，按1∶16（體積質量比）加入4%NaCl溶液，振蕩處理2 h，再浸提6 h[19,20]。6 000 r/min離心15 min，去上清液，得沉淀，用清水清洗，30℃烘干至恒量，備用。

1.2.3蛇皮膠原蛋白酶法提取

稱取適量經預處理的蛇皮，在最適pH值條件下加入適量體積的檸檬酸（0.1 mol/L）提取液[19]，加入適量木瓜蛋白酶，振蕩，一定溫度下，酶解一定時間。提取結束后，95℃滅酶10 min[21]，6000 r/min離心15 min，收集上清液，即可得到粗提膠原蛋白溶液，于-18℃冰箱保存備用[19,20]。

1.2.4膠原蛋白提取率測定

按GB/T 96925.23-2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》測定羥脯氨酸含量，乘以相應系數而得膠原蛋白的含量[22]。采用水生動物系數11.1換算[23]。

1.2.5試驗方案

（1）單因素實驗

試驗以膠原蛋白的提取率為目標參數，分別研究溫度、pH、固液比、酶濃度、提取時間5個單因素對提取率的影響。

（2）正交實驗

經單因素試驗設計檸檬酸為提取溶劑，選取酶解時溶液pH值（A）、固液比（B）、酶濃度（C）、提取時間（D）作為主要參考因素，以干燥后得率為考查指標，采用正交表L9（34）進行4因素、3水平正交試驗，試驗因素水平見表1。

表1　正交試驗設計表

2　結果與討論

2.1單因素試驗

2.1.1提取溫度對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

由圖1可知，當酶濃度、提取時間、pH和料液比一定時，隨著溫度的升高，膠原蛋白的得率逐漸增加。在30℃時，達到最高值，得率為87.44%。隨著溫度的繼續升高，得率開始呈現下降趨勢。40℃時，膠原蛋白的得率降為77.31%，下降幅度較大?？梢?，當其他因素一定時，提取溫度對膠原蛋白提取率的影響較大，蛇皮中膠原蛋白的最佳提取溫度在30℃左右。溫度太低，木瓜蛋白酶無法發揮最佳作用，膠原蛋白酶解不完全。溫度太高，膠原蛋白易變性分解。

圖1　　提取溫度對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

2.1.2不同pH值對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

由圖2可知，當料液比、提取時間、溫度、酶濃度一定時，隨著pH的增加，得率呈先增加后減少趨勢。在pH 6.0～7.0，得率較高，是由于在此pH范圍內分子內電荷達到了平衡狀態，提高了膠原蛋白的溶解速度?？梢姰斊渌蛩匾欢▋H分析pH對膠原蛋白提取率的影響，可知酶解溶液pH為6時效果最佳。由此也可知pH對酶水解活力的影響較大，但在膠原蛋白提取實際應用中還受其他因素的影響。

圖2　不同pH值對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

2.1.3不同固液比對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

由圖3可知，當提取溫度、酶濃度、提取時間及pH一定時，隨著固液比的逐漸增大，膠原蛋白的得率變化忽高忽低，但總體而言差異不明顯，均為70%左右。可見，固液比對蛇皮中膠原蛋白提取率影響較小，可能是因為提取溶劑的體積對酶活力的影響較小。再者考慮到成本和提取后廢液處理等因素，最后確定只需將蛇皮完全浸沒，固液比以1∶10即可。

圖3　　不同固液比對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

2.1.4不同酶濃度對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

在最適溫度下，相同固液比、提取時間、pH值條件下，不同酶濃度所測得的膠原蛋白提取率如圖4所示。隨著酶濃度的不斷上升，提取率越來越高，當酶濃度增加至3.0%時提取率上升至最高，但升高趨勢較平緩。

圖4　　不同酶濃度對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

2.1.5不同提取時間對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

由圖5可知，當固液比、提取溫度、pH和酶濃度一定時，得率在提取時間為24 h時達到最高點，為98.76%。32 h時得率為96.55%，呈現下降的趨勢?？梢?，提取時間過短，膠原蛋白酶解不徹底，產物少；時間過長，膠原蛋白部分發生水解，影響提取得率。

圖5　　不同提取時間對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

2.2正交實驗

由極差分析結果可知，各因素對膠原蛋白提取率影響程度依次為：pH值＞酶濃度＞固液比≈提取時間。木瓜蛋白酶提取蛇皮中膠原蛋白最佳因素水平組合為A1C3B2D2，即pH值6，酶濃度3.00%，提取時間為24h，固液比為1∶10。在此條件下得膠原蛋白的提取率為89.30%（見表2）。經重復驗證，該方案可行。

表2　　正交試驗結果分析

3　結論

本試驗重點研究了木瓜蛋白酶提取蛇皮膠原蛋白的影響因素，對最佳工藝條件進行了分析，結果表明：木瓜蛋白酶提取蛇皮膠原蛋白的適宜工藝條件為提取溫度30℃、pH值6、酶濃度3.0%、固液比1∶10、提取時間24 h。

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中圖分類號:TS255.36

文獻標識碼：A

文章編號：1674-2109（2015）06-0026-05

收稿日期：2015-03-15

基金項目：福建省科技廳重點項目（2012Y0063）。

作者簡介：吳玉瓊（1973-），女，漢族，副教授，主要研究方向：食品營養、食品工藝。

Research Process on the Extraction of Collagen with Papain from the Skin of Snake

WU Yuqiong1，LUO Hongxia1，HU Yongle1，ZHANG Jing1，WEN Aiguo2
（1.School of Tea and Food Science,Wuyi University,Wuyishan Fujian 354300; 2.Wuyishan Snakes Research Institute,Wuyishan，Fujian 354300）

Abstract:Collagen of extraction was studied from the farmed snake skin.The extraction technology including pH,papain concentration, immersion temperature,solid-liquid,immersion time was discussed.The results indicated that the optimum extracted conditions are as follows:at 30℃,in 0.1 mol/L citric acid buffer solution,the added enzyme dosage is 3.00%and the weight ratio of skin to solvent is 1 to 10,immersion time is 24 h.the recovery of the collagens was 89.30%.

Key words:snake skin;collagen;papain;optimal parameters