鹽酸吡格列酮與胃蛋白酶之間的相互作用及對藥效、胃部消化能力的影響

王春丹， 劉保生， 邊 剛， 馬麗花， 張紅彩， 程 旭

(河北省分析科學技術重點實驗室， 國家級化學實驗教學示范中心(河北大學)， 藥物化學與分子診斷教育部重點實驗室， 河北 保定 071002)

1 引 言

鹽酸吡格列酮(PGH)屬于治療2型糖尿病的常用藥物[1]。其主要副作用除了服用劑量過多時發(fā)生低血糖造成患者昏迷、甚至死亡[2-3]外，還有惡心、嘔吐、腹痛、疲勞、厭食、黑尿等副作用。但有關口服藥物對人體消化功能影響機理的光譜法研究至今未見報道。

胃蛋白酶(PEP)由327個氨基酸殘基組成并且含有具有內(nèi)稟熒光體的13個酪氨酸(Tyr)殘基、5個色氨酸(Trp)殘基和13個苯丙氨酸(Phe)殘基[4]。胃蛋白酶是脊椎動物胃黏膜中以酶原形式產(chǎn)生的典型的天冬氨酸蛋白酶[5]，由N端結構域(殘基1～175)和C末端結構域(殘基176～327)兩個同源結構域組成[6]。它作為人體消化系統(tǒng)中一個重要的蛋白酶，食物、藥物在進入胃時首先與胃蛋白酶相互作用。同時，胃蛋白酶的活性也可能受到食物、藥物的影響。目前，胃蛋白酶常被用作消化蛋白酶的一個重要模型來研究小分子與蛋白質(zhì)的相互作用，但尚未見采用光譜法研究PGH與PEP之間的作用機理的文獻報道。本文通過傳統(tǒng)熒光光譜法、同步熒光光譜法以及分子對接法，研究了PGH與PEP之間的相互作用機理并定量研究了PGH與PEP之間的相互作用對藥物的藥效及胃部消化功能的影響情況。該方法簡單、快速，研究結果與藥物實際對消化功能的副作用一致。

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

試劑：PEP(純度≥99%，Sigma公司)，配成濃度為 1.0×10-4mol/L 的儲備液；PGH配成1.0×10-3mol/L 的儲備液；HAc-NaAc緩沖溶液(pH=2.00±0.02，含0.10 mol/L NaCl)。實驗用水皆為二次石英蒸餾水，以上儲備液于4 ℃下避光保存。

儀器：島津RF-5301PC熒光分光光度計；SYC-15B 超級恒溫水浴；SZ-93自動雙重純水蒸餾器。

2.2 實驗方法

2.2.1 熒光光譜測定

分別在298，310，318 K下，向一系列10 mL比色管中，分別加入HAc-NaAc緩沖溶液1.0 mL，PEP(1.0×10-5mol/L)溶液2.0 mL和不同體積的PGH(1.0×10-3mol/L)溶液，定容并水浴恒溫靜置30 min。狹縫寬度設為5 nm，λex=280，295 nm時，掃描熒光光譜。Δλ=15，60 nm時，掃描同步熒光光譜。

2.2.2 分子對接

在蛋白數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)得到PEP的晶體結構(PDB ID: 5PEP)，利用軟件ChemDraw Pro 14.0和軟件ChemBio 3D Ultra 14.0對PGH的結構進行處理。在AutoDock 4.2.6軟件對PGH和PEP進行分子對接，主要采用遺傳算法來計算與蛋白質(zhì)和藥物分子結合的可能構象[7]。

3 結果與討論

3.1 PGH與PEP體系的熒光光譜

PGH-PEP體系的熒光光譜見圖1。由圖1可知，在λex=280 nm時，PEP最佳熒光發(fā)射峰的波長為347 nm，且隨著PGH濃度的增加其有規(guī)律地下降(激發(fā)波長為295 nm時，PGH-PEP體系的熒光光譜與其類似)，表明PGH與PEP反應，使得PEP的熒光發(fā)生猝滅效應[8]。

通過其Stern-Volmer[9]猝滅常數(shù)KSV和猝滅速率常數(shù)kq與溫度的相關性可以區(qū)分其作用機制：

F0/F=1+kqτ0[Q]=1+KSV[Q]，

(1)

其中F0、F分別為無、有猝滅劑時的熒光強度；τ0

CPEP=2.0×10-6mol/L, 1～9CPGH=(0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0)×10-5mol/L和[Q]分別為分子熒光平均壽命(約為10-8s)和猝滅劑的濃度。不同溫度的計算結果列于表1。由表1可知，KSV與kq值隨著溫度的升高均呈現(xiàn)降低趨勢，可見該體系的猝滅方式為靜態(tài)猝滅；不同溫度下的kq均大于各類猝滅劑對生物分子的最大碰撞擴散常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)[10]，也印證了該體系的猝滅類型為靜態(tài)猝滅的正確性。

圖1 PGH-PEP的熒光發(fā)射光譜(T=298 K，λex=280 nm)

Fig.1 Fluorescence emission spectra of PGH-PEP system (T=298 K,λex=280 nm)

為了進一步得到結合常數(shù)(Ka)、結合位點數(shù)(n)等信息，運用公式(2)[11]處理，結果一并列入表1：

(2)

表1 不同溫度下 PGH-PEP 體系的猝滅反應參數(shù)

r1為方程F0/F-[Q]的線性相關系數(shù)；r2為方程lg[(F0-F)/F]-lg{[Dt]-n[Bt](F0-F)/F}的線性相關系數(shù)。

其中，[Dt]和[Bt]分別為PGH和PEP總濃度。以lg{(F0-F)/F}對lg{[Dt]-n[Bt](F0-F)/F}作圖，根據(jù)斜率和截距可得到n和Ka值并列于表1。由表1可知n≈ 1，說明PGH與PEP結合時只存在一個高親和力結合位點[12]，即PGH與PEP結合形成1∶1的復合物。溫度升高Ka降低可知溫度升高使PGH與PEP的結合能力降低，表明PGH-PEP體系發(fā)生了靜態(tài)猝滅[13]。在熒光光譜實驗中，λex=280 nm時可以同時激發(fā)蛋白的Tyr和Trp殘基的熒光；λex=295 nm時只能激發(fā)蛋白的Trp殘基的熒光。由相同溫度下Ka(λex=280 nm)>Ka(λex=295 nm)可知，PEP中的Tyr和Trp殘基均參與了反應。相關系數(shù)r1、r2均大于0.99，說明了數(shù)據(jù)的可靠性以及計算結果的準確性。圖2為PEP中的Tyr和Trp殘基參與情況。由圖2可見，λex=280，295 nm時的猝滅曲線沒有重疊，并且λex=280 nm熒光猝滅程度比λex=295 nm時大，說明在PGH與PEP結合的過程中，PEP的Trp與Tyr殘基均參加反應且PEP的Trp殘基參與反應的程度更大。

CPEP=2.0×10-6mol/L,CPGH=5.0×10-6～1.0×10-4mol/L

圖2 PGH與PEP作用的相對熒光曲線(T=298 K)

Fig.2 Relative fluorescence curves of the interaction between PGH and PEP(T=298 K)

3.2 PGH與PEP體系的同步熒光光譜

同步熒光光譜能夠給出分子環(huán)境信息，尤其是在熒光基團附近[14]。圖3為PGH-PEP體系的同步熒光光譜。Δλ=15 nm (Tyr殘基)的熒光猝滅程度遠小于Δλ=60 nm (Trp殘基)的熒光猝滅程度，表明PEP的Trp殘基參與反應程度比Tyr殘基大[15]。圖3(a)中的熒光峰并沒有隨著PGH加入而發(fā)生位移，說明PGH與PEP的結合不改變PEP中Tyr殘基周圍的微環(huán)境；圖3(b)中PEP 344 nm處的熒光峰隨著PGH加入紅移至346 nm，說明PGH與PEP的結合改變了PEP中Trp殘基周圍的微環(huán)境，使PEP疏水性降低[16]。

CPEP=2.0×10-6mol/L, 1～8CPGH=(0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 7.0, 9.0, 10.0)×10-5mol/L

圖3 PGH-PEP體系的同步熒光光譜(T=298 K )。(a) Δλ=15 nm;(b)Δλ=60 nm。

Fig.3 Synchronous fluorescence spectra of PGH-PEP system (T=298 K). (a) Δλ=15 nm. (b) Δλ=60 nm.

3.3 PGH-PEP體系結合率

當藥物與蛋白結合達到動態(tài)平衡時，蛋白一部分為游離型蛋白，另一部分為結合型蛋白。若蛋白有n個相同且獨立的結合位點時，PGH-PEP體系存在如下反應：

[B]+n[Q]→[BQn]，

(3)

如果蛋白B與藥物Q的相互作用符合Langmuir單分子吸附模型[17]，則平衡常數(shù)Ka為：

(4)

當n=1時，即PGH與PEP以1∶1比例結合時，則：

(5)

假設PGH總濃度為Q，PEP總濃度為B，PGH-PEP復合物濃度為x，則Ka亦表示為：

(6)

解該一元二次方程，經(jīng)整理得：

x=

(7)

則藥物結合率可表示為：

100%，

(8)

蛋白結合率為：

100%，

(9)

以本實驗的PEP濃度2.0×10-6mol/L、PGH濃度2.0×10-5～1.0×10-4mol/L，由表1中不同溫度下Ka值結合公式(8)、(9)計算了不同溫度下的W(Q)和W(B)值。得W(Q)：0.83%～0.62%(298 K)、0.67%～0.53%(310 K)、0.57%～0.46%(318 K)，表明隨著藥物濃度的增大W(Q)值減小，但是變化程度非常小(小于1%)，故PGH與PEP 的結合對PGH的藥效的影響很小，可以忽略不計；W(B)的變化范圍為：8.31%～31.23%(298 K)、6.73%～26.53%(310 K)、5.67%～23.11%(318 K)，可見隨著PGH濃度增大，蛋白結合率增大。以310 K數(shù)據(jù)6.73%～26.53%為例，表明PGH與PEP的結合將使得PEP游離濃度減小6.73%～26.53%，即由于PGH與PEP的結合使得PEP的游離濃度由100%減小到93.27%～73.47%，由此可推斷PGH與PEP的結合作用將會對胃部的消化能力產(chǎn)生一定的影響。設R=Q/B，分別以W(Q)和W(B)對R作圖，如圖4。從圖4中可以看出，隨著溫度的升高，W(Q)值很小，呈下降趨勢；而W(B)值較大且呈升高趨勢。對310 K時的曲線做非線性擬合可得結合模型：W(Q)=2.088×10-5R2-0.0048R+0.718，相關系數(shù)r=0.999 3；W(B)=-0.0029R2-0.6689R+0.3670，相關系數(shù)r=0.999 7。

PGH的實際服用劑量為每次15～45 mg，人體胃液量按50 mL計算，則PGH在胃液中濃度為7.64×10-4～2.29×10-3mol/L，PEP在胃液中濃度為2.6×10-8～4.3×10-8mol/L[18]。由實驗所得310 K的Ka值及公式(8)、(9)計算，0.0013%≤W(Q)≤0.0032%，值非常小，表明此時PGH與PEP的結合對PGH藥效的影響很小，幾乎可以忽略不計；而69.76%≤W(B)≤87.37%數(shù)值很大，表明服用PGH后，用來起消化作用的游離PEP僅剩30.24%～12.63%，由此推測由于服用PGH后PGH與PEP的結合使得游離PEP濃度大幅度降低，將對胃部的消化能力造成嚴重影響，即服用PGH之后可能引起惡心、嘔吐以及胃部不適等，這與PGH藥物說明書服用PGH所引起胃部的副作用相符。

圖4 PGH的結合率與PEP的結合率

Fig.4 Binding rate of PGH and the binding rate of PEP

3.4 PGH與PEP體系的作用力類型

由體系的自由能(ΔG)、焓(ΔH)和熵(ΔS)來推斷體系的作用力類型[19-20]。可通過公式(10)[21]及表1中不同溫度下的Ka值進行計算，結果列于表2：

ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS，

(10)

根據(jù)表2，ΔG<0表明PGH-PEP的相互作用可以自發(fā)進行[22]；ΔS>0表明PGH-PEP的相互作用是熵增加過程；ΔH<0表明PGH-PEP的結合是放熱過程，溫度升高不利于反應進行，即溫度升高使PGH與PEP結合能力減弱；該結論與表1中Ka隨溫度升高而降低結論一致。同時ΔS>0、ΔH<0，表明PGH與PEP的結合作用以靜電引力為主[23]。

表2 不同溫度下PGH-PEP體系的熱力學參數(shù)

3.5 PGH與PEP體系的協(xié)同性

利用Hill方程[24]計算Hill系數(shù)nH：

lg{Y/(1-Y)}=lgKa+nHlg[L]，

(11)

Y和Ka分別表示結合飽和分數(shù)、結合常數(shù)。其中：

Y/(1-Y)=Q/(Qm-Q)，

(12)

Q=1-I/I0，

(13)

1/Q對1/[L]作圖的截距為1/Qm。PGH-PEP體系的nH計算結果見表3。nH大于1時表示第一種配體與后繼配體之間為正協(xié)同作用即PGH-PEP的結合有利于后繼配體再與PEP結合；nH<1表示第一種配體與后繼配體之間為負協(xié)同作用即PGH-PEP的結合不利于后繼配體再與PEP結合；nH=1表示第一種配體與后繼配體之間為零協(xié)同作用即PGH-PEP的結合不影響后繼配體再與PEP結合。由表3中的數(shù)據(jù)可知nH在1.02～1.15范圍內(nèi)，數(shù)值均大于1，由此可以說明PGH與PEP結合后對后繼配體與PEP結合能夠產(chǎn)生一定的促進作用。兩種方法所得結果一致。

表3 不同溫度下PGH-PEP體系的Hill系數(shù)

nH為PGH-PEP體系的Hill系數(shù)；r3為方程lg[Y/(1-Y)]-lg[L]的線性相關系數(shù)。

3.6 分子對接

PEP的二級結構有4個能明顯區(qū)分的區(qū)域，其中第一個區(qū)域是由6條反向平行鏈組成的β-折疊結構，從而形成的分子骨架。β-折疊的形成進一步確立了PEP的催化活性位點[25]，催化活性位點主要由天冬氨酸ASP32和ASP215組成。圖5(a)為PGH與PEP的最佳結合位置。分子對接結果顯示，PGH-PEP的結合能ΔG=-21.37 kJ·mol-1，與表2實驗結果ΔG較為一致，表明這一結合模式可以較為真實地反映PGH與PEP的相互作用方式。圖5(b)為PGH分子周圍氨基酸殘基示意圖，PGH被氨基酸殘基ASP215、THR218、SER219、GLU288、LEU220、MET290、GLY217、ASP32、GLY76、THR77、GLY78、PHE111、TYR75、PHE117、ILY120、TRP39所包圍，并與LEU229形成氫鍵，鍵長為0.213 4 nm。結合熒光光譜的實驗結果，可見PGH-PEP體系的結合是由靜電引力與氫鍵作用力共同驅動，PGH與PEP的結合位點在Trp和Tyr殘基附近說明PGH能夠使PEP發(fā)生熒光猝滅，由此可以說明分子對接的結果與熒光法結果是一致的。從圖5(b)中可以看出PGH周圍的氨基酸殘基包含ASP215和ASP32，由此可見PGH與PEP的結合位置位于PEP的催化活性位點處。

圖5 PGH與PEP相互作用的分子對接圖。(a)PGH與PEP發(fā)生作用區(qū)域;(b)PGH與PEP活化中心發(fā)生作用的氨基酸殘基。

Fig.5 Computation docking model of the interaction between PGH and PEP. (a) PGH located within the hydrophobic pocket in PEP. (b) Detailed illustration of the amino acid residues lining the binding sitein the PGH and PEP cavity.

4 結 論

以熒光光譜法和分子模擬技術探討了PGH與PEP之間的相互作用，建立了PGH-PEP的體外結合模型。結果證明PGH能夠自發(fā)地在靜電引力與氫鍵作用力的驅動下與PEP結合，并且僅有一個結合位點，該結合位點位于PEP的催化活性中心處。PGH-PEP復合物的生成使PEP中發(fā)色基團微環(huán)境發(fā)生改變，且對于后繼藥物存在正協(xié)同作用。通過結合常數(shù)計算了蛋白結合率和藥物結合率，定量闡述了PGH與PEP的相互作用對藥物藥效及消化功能的影響。PGH與PEP相互作用的光譜法研究對于合理用藥與新藥的研發(fā)均具有指導意義，且方法簡單、快速。