轉基因棉花研究與應用進展

李常鳳　鄭曙峰

摘 要：轉基因技術在棉花種質創新和新品種選育方面取得了較大發展。該文綜述了棉花轉基因技術方法，系統地論述了轉基因在棉花抗蟲、抗除草劑、抗病、抗逆境以及高產優質等方面的研究進展，分析了轉基因棉花產業相關問題，并概述了轉基因抗蟲棉育種成就及潛力。

關鍵詞：棉花；轉基因技術；研究進展；綜述

中圖分類號 S562 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）03-04-17-05

Abstract：Great progress through transgenic technology have been made on cotton germplasm innovation and breeding. This paper summarized transgenic cotton advances in insect resistance，herbicide tolerance，disease resistance，stress tolerance，as well as yield and quality improvement of fiber. Meanwhile，an assessment of transgenic cotton industry and its potential in transgenic breeding were present.

Key words：Cotton；Transgenic technology；Research progress；Summarize

棉花（Gossypium hirsutum L.）是我國重要的經濟作物，是關系國計民生的重要戰略物資。長期以來，以雜交育種為主的傳統育種技術在提高棉花產量、纖維品質以及抗逆性等方面取得了一定進展，并獲得了可觀的社會效益和經濟效益。但由于棉花產量性狀和品質性狀之間呈現遺傳負相關，單純依靠常規育種技術在較短時間內難以實現棉花產量和纖維品質的大幅度同步提要[1-2]。現代生物技術尤其植物基因工程的迅速發展為棉花種質資源創新提供了新的思路和方法，它可以打破物種間的生殖隔離，通過直接或間接的轉移手段有目的、有計劃的向棉花體內引入控制性狀遺傳的優良基因，在無需改變原有特性的條件下，打破基因不良連鎖，實現生物性狀的定向改變。利用轉基因技術手段提高棉花產量、改良纖維品質以及增強抗蟲、抗病和抗逆性，是常規育種的重要補充。我國早在20世紀80年代末就開始了轉基因棉花的研究與開發利用，現就棉花轉基因方面的研究與應用進行綜述。

1 棉花轉基因的主要方法和平臺

植物遺傳轉化的研究早在20世紀60～70年代就已經開始了，包括農桿菌介導法、基因槍法、顯微注射法、電擊法、PEG法、超聲波法等。發展到現在，棉花的轉基因方法主要有3種：農桿菌介導法（Agrobactetium-mediated gene tansfer）、基因槍轟擊法（particle bombardment）和花粉管通道法（pollen tube pathway）。

1.1 農桿菌介導法 農桿菌是普遍存在與土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，主要分為2大類：根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）和發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）。目前應用較多的是根癌農桿菌，被譽為“自然界最小的遺傳工程師”[3]。根癌農桿菌的Ti質粒上有一段T-DNA區，人們將目的基因插入到改造后的T-DNA區，借助農桿菌的侵染能力，經過一系列過程，實現外源基因的轉移和整合。該方法的受體材料主要包括：下胚軸、子葉、莖尖分生組織[4]、愈傷組織、胚性愈傷組織[5]和幼胚等。棉花的遺傳轉化常采用Ti質粒，以下胚軸為受體材料，導入與轉化的成功率達到80%。1987年，Umbeck等[6]和Firoozabady等[7]首次報道了利用農桿菌介導法遺傳轉化棉花獲得轉基因植株，之后國內外在轉基因組織培養再生體系的建立方面研究迅速并取得巨大進展[8-10]。目前在生產上應用的諸多轉基因棉花品種都是通過該方法得到的[6]。

1.2 基因槍轟擊法 基因槍轟擊法又被稱為粒子轟擊技術（paticle bombardment）或高速微粒子發射技術（high-velocity micro-projectile），是繼農桿菌介導法之后應用最廣泛的一種技術。其主要原理是借助火藥爆炸、高壓放電或者高壓氣體驅動等作為動力，將載有外源基因的鎢或金粉粒導入受體細胞，使其整合到受體基因組內進而得到表達。該方法轉化棉花的靶受體廣泛，包括愈傷組織、胚性懸浮細胞、莖尖分生組織、幼胚以及花粉等[11]；但是轉化頻率低，遺傳穩定性較差[12]。1990年，Finer等[13]以棉花胚性懸浮細胞為受體最先通過基因槍轟擊法遺傳轉化棉花并收獲轉基因植株。

1.3 花粉管通道法 植物授粉后，一些珠心細胞退化在珠孔和胚囊之間形成花粉管通道，將外源DNA涂于授粉后的受體作物的柱頭上，或注射到其子房中，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期的胚胎細胞，并進一步整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵發育而成為轉基因新個體[14]。主要操作方式有：微注射、花粉粒攜帶、柱頭滴加和子房注入等[14]。該方法轉化效率比較低，一般在2%左右，而且受環境及人為操作影響較大。不過操作簡單并且可以直接獲得轉基因棉花種子，與常規育種結合，在選育高產、優質、多抗轉基因棉花新品種中發揮了重要作用。目前，通過該方法得到的部分轉基因抗蟲棉品種（品系）已審定并在生產上大面積推廣應用。

1.4 棉花規模化轉基因技術體系平臺 中國農科院棉花研究所李付廣團隊與國內相關研究單位合作，建立了以農桿菌介導法和花粉管通道法為主、基因槍法為輔的棉花高效轉基因技術體系，并將植株嫁接技術成功應用于轉基因苗的移栽，成活率高達90%，有效解決了再生苗成活率低的難題，年產轉基因植株6 000株以上，初步實現了棉花轉基因的規模化。進一步通過田間篩選、室內鑒定和分子檢測對獲得的轉基因植株進行快速篩選，有針對性地系統開展安全性評價、生態區推廣和新品種推廣。

該技術體系將多種轉基因技術進行了有效組裝，實現了流水線操作，既提高了工作效率，又降低了經濟成本。近年來。利用該技術體系累計為國內41家單位轉化基因234個，創制種質材料621份，成功獲得中棉所17、中棉所27、泗棉3號等16個轉基因棉花新品種。至2005年，在冀、豫、魯、皖、鄂、蘇等6個產棉省累計推廣國產轉基因棉達409.62萬hm2，社會經濟效益達93.8億元。該體系的建立對于促進我國棉花生物技術育種以及加速其產業化進程具有重要意義，處于國內同類研究的領先地位，已達到國際先進水平[15]。

1.5 棉花組織培養性狀純化及外源基因功能驗證平臺 中國農科院棉花研究所李付廣團隊將“棉花葉柄組織培養與高分化率材料選育方法（專利號：ZL200610089439.1）”和“一種棉花枝條扦插方法及其專用扦插生根劑（專利號：ZL200510088962.8）”兩項專利技術結合，定向篩選出高分化率材料，并建立了穩定的組織培養體系。在此基礎上，篩選出3類與該體系相適宜的高效轉化載體，大大提高了轉化效率。

“外源基因在棉花上快速功能驗證的技術平臺”年轉化驗證外源基因160余個。對156個候選基因進行轉化驗證的過程中，篩選出2 000余份富有利用價值的種質材料，865份穩定遺傳的變異材料。對已獲得的轉基因材料充分利用，相繼培育出中棉所50、中棉所47、中棉所52等24個新品種，其中12個通過國家審定，12個通過省級審定；進一步被引用后又衍生出20余個轉基因棉花新品種/系，累計創造社會經濟效益17.98億元。

2 棉花全基因組測序

對于每個生物個體而言，基因組包含了其全部的遺傳信息，利用測序技術破解基因組信息，是生物科學研究的重要手段。2007年，中國農業科學院棉花研究所聯合深圳華大基因研究院、美國農業部南方平原研究中心等優勢單位，率先在國際上啟動了“棉花基因組計劃”（Cotton Genome Project，CGP）。分別于2012年和2014年相繼完成了二倍體雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）（D基因組）和二倍體亞洲棉（Gossypium arboreum L.）（A基因組）全基因組遺傳圖譜的繪制，相關論文均發表于國際權威學術期刊《自然-遺傳學》（Nature Genetics）[16-17]。棉花基因組信息的獲得，標志著我國棉花基因組學研究已取得了國際領先水平。為陸地棉（Gossypium hirsutum L.）和海島棉（Gossypium barbadense L.）等四倍體基因組分析提供了信息基礎，為闡明棉花起源與進化、揭示四倍體棉種形成機制、解析高產與優質的遺傳機理、實現基因水平上的分子設計育種均具有重要意義。

3 應用于棉花的主要基因

目前應用于棉花育種的目的基因主要包括抗蟲基因、抗除草劑基因、抗病基因、抗逆性基因和品質產量改良基因等。

3.1 抗蟲基因 在我國，應用于棉花的抗蟲基因主要有蘇云金芽孢桿菌的內毒素蛋白基因（Bacillus thuringiensis，Bt）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI）和植物凝集素基因（lectin）。

Bt基因是研究最多、進展最快及應用最廣泛的一類基因，它對鱗翅目昆蟲具有專一殺傷作用，其種類很多，但是獲得的轉基因抗蟲棉的Bt基因僅有少數幾種，如Cry1A、Cry1A（b）、Cry1A（c）等[18]。CPTI基因是從豇豆中分離得到，其基因產物是一種約含80個氨基酸的小分子多肽，其通過抑制胰蛋白酶的活性來干擾昆蟲的消化作用，使其得不到充足的影響，導致發育不良，最終死亡。CpTI基因對天峨類、夜蛾類、葉甲類及灰翅夜蛾類等多類害蟲有廣譜抗性。植物凝集素是一類能夠特異性識別糖類物質并與之結合的活性球蛋白，對同翅目害蟲如棉蚜蟲有極強的抗殺作用。目前應用較多的主要有豌豆凝集素（P-lec）、雪花蓮凝集素（GNA）和半夏凝集素（PTA），其中P-lec和GNA對害蟲具有極強的抗殺作用，同時對人類幾乎無毒害。

1991年，謝道昕等[19]在國內首次報道了將B.t.aizawai 7-29和B.t.kurstaki HD-1基因分別導入陸地棉品種。1998年，倪萬潮等[18]將人工合成的Cry1A基因導入棉花，獲得了高抗棉鈴蟲的轉基因植株，是我國成為第二個獨立成功研究轉基因抗蟲棉并擁有自主知識產權的國家。早期的抗蟲棉采用單一抗蟲基因，存在抗蟲單一、害蟲易產生耐受性等問題。1999年，郭三堆等[20]將人工合成的GFM Cry1A和經過修飾的CpTI的雙價抗蟲基因導入棉花，首次獲得了高效雙價轉基因抗蟲棉株系。郭洪年等[21]將Cry1Ac/API2B基因導入棉花，獲得了抗棉鈴蟲90.0%～99.7%且農藝性狀優良的9個雙價抗蟲棉純合品系。我國雙價抗蟲棉的研制成功和大面積試種示范，對減少農藥施用和保護環境，實現農業可持續發展具有巨大而深遠的影響。

3.2 抗除草劑基因 棉田中雜草種類繁多，影響了棉花的正常發育，給生產造成嚴重干擾。將外源抗除草劑基因導入棉花，使棉株具備某種除草劑抗性意義重大。在我國，成功應用于棉花的抗除草劑基因有：抗草甘膦（glyphosate）基因、抗2，4-D單氧化酶基因（tfdA）和抗溴苯腈（bromoxyril）基因。

草甘膦是目前應用最為廣泛的一種非選擇性光譜除草劑，能夠特異性的抑制植物和細菌體內莽草酸羥基乙烯轉移酶（EPSPs）的活性。1995年，上海植物生理研究所首次通過輻射育種得到一個耐草甘膦的種質系，不過其抗草甘膦能力只有田間用藥濃度的90%。祝水金等[22]篩選抗草甘膦突變體庫獲得穩定遺傳的抗草甘膦種質系。劉錫娟等[23]、謝龍旭等[24]分別將抗草甘膦基因EPSPs和突變基因（aroAM12）導入棉花，獲得對草甘膦給具有較強抗性的轉基因棉。

2，4-D是一種非常穩定的激素型除草劑，通過干擾植物細胞分裂的速率達到除草目的，但其能被微生物體內的2，4-D單氧化酶所分解。棉花對2，4-D非常敏感，將外源的tfdA基因導入棉花后可大大提高棉花對2，4-D的抗性。1994年，陳志堅等[25]成功將tfdA基因導入晉棉7號，抗性試驗表明，轉基因后代可耐0.08%以上的2，4-D，超過一般大田施用濃度。郭寶生等[26]選育的抗2，4-D棉花新材料，同樣也獲得了良好的效果。

溴苯腈是一種觸殺型除草劑，主要通過抑制植物光合作用過程中電子傳遞，使組織迅速壞死發揮除草作用。

3.3 抗病基因 棉花的整個生育過程中遭受多種病菌的侵害，其中以黃萎病和枯萎病這兩種土傳性真菌病害最為嚴重，尚無法根治，成為棉花生產的主要障礙。近年來，應用于棉花基因工程的主要有幾丁質酶（CHI）、β-1，3-葡聚糖酶（Glu）和葡萄糖氧化酶（GO）等外源抗病基因。

幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶是植物防御體系中的兩種防衛因子，兩者之間存在協同增效作用。劉桂珍等[27]通過激光微束穿刺法將含有β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶基因的雙價載體pLGC導入棉花幼胚，進而選育出對黃萎病具有較高抗性的轉基因棉花株系。

葡萄糖氧化酶通過催化B2D2葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2，誘發植物的抗病反應，還可以作為第二信使誘導植株抗性系統形成。研究表明，轉GO基因的棉花對黃萎病和枯萎病的抗性具有顯著提高[28]。吳家和等[29]通過農桿菌介導法，將維管束特異啟動子啟動的幾丁質酶和CaMV35S啟動的β-1.3-葡聚糖酶嵌合雙價基因導入棉花，獲得3個雙抗轉基因純合系。

3.4 抗逆性基因 鹽堿、干旱、高低溫和澇漬等對棉花的生長發育產生顯著影響。近年來，圍繞棉花抗鹽堿、抗寒、、抗旱以及抗衰老等方面開展了一系列研究，并已取得一定進展。

沈法富等[30]將羅布麻DNA導入魯棉后，轉基因植株后代的抗鹽性及抗枯萎病均有所提高。呂素蓮等[31]將甜菜堿合成中關鍵酶膽堿脫氫酶基因betA和乙酰乳酸合成酶的突變基因als基因導入3個棉花優良品種中，轉基因植株的耐鹽性得到明顯提高。異戊烯基轉移酶基因（ipt）編碼蛋白控制細胞分裂素的生物合成，在特異蛋白啟動子控制下將其導入棉花，發現再生植株的根系更加發達[32]。將紫稈檉柳晚期胚胎發生豐富蛋白（LED）基因導入新陸早18號，在干旱脅迫誘導下，轉基因棉表現出了優良的生長和生理優勢，抗旱能力明顯提高[33]。

3.5 優質高產基因 棉花纖維的強度、長度和細度等品質性狀是評價棉花質量的重要標準，提高棉纖維品質是當前棉花育種工作的一個重點，轉基因技術與常規育種相結合加速了纖維品質改良進程。

棉纖維特異啟動子E6驅動兔角蛋白基因通過花粉管通道技術導入棉花，獲得穩定遺傳轉基因株系，其纖維品質得到部分改良，尤其比強度得到大幅度提高[34]。黃全生等[35]將蜘蛛絲蛋白基因通過基因槍轟擊進去海島棉莖尖，得到強度高和韌性好的優質纖維。開花相關基因FAC基因最早發現于擬南芥，其含有兩個RNA識別基序的結構域（RNA recognition motif，RRM）和一個WW蛋白質相互作用基序[36]。研究結果證明兩個OsFCA-RRMs異位表達均能使細胞增大，產量提高，即在細胞大小調控中均發揮重要的的作用。Os-csRRM1和Os-csRRM2在植物中呈現非常高的進化保守性。序列比對分析還發現，它們與小麥、大麥、黑麥、蓖麻、葡萄和油菜具有極高的同源性，表明RRMs在不同植物中可能具有相似的功能[37-38]。Sun等[39]從油菜（Brassica napus）中克隆得到Bn-csRRM2基因，遺傳轉化棉花結果發現轉基因棉花的花粉、子葉柄和棉纖維等多種類型的細胞增大，花、子房、子葉、葉片和萼片等器官變大以及整株變高，單鈴重可達7.5g，纖維長度增加10%左右，產量與對照相比增幅范圍為35%～66%。轉FBP7：iaaM基因棉花衣分高達47%～50%，而非轉基因對照僅為37%～40%；纖維產量提高了23%～34%；纖維細度也得到顯著改善[40]。中棉所利用海島棉優質漸滲系與轉基因抗蟲棉品系雜交、分子聚合技術培育出“中棉所70”，其纖維長度為32.5mm，達到了優質棉標準。

4 轉基因棉花育種與應用

近年來，隨著轉基因技術的發展，從單一的農桿菌侵染到基因槍轟擊、真空滲透等，棉花轉基因方法和途徑得到較大拓展。與此同時，伴隨著基因克隆技術的發展，一些優良內源或外源基因不斷得到克隆，為棉花轉基因提供更多基因資源，也獲得了一批又一批的轉基因棉花，諸如各種轉基因抗蟲棉、抗病棉、抗逆境棉和轉基因優質棉。其中，轉基因抗蟲棉在生產上已經得到大規模商業化推廣和應用，獲得了顯著的經濟效益、生態效益和社會效益。2000-2009年是我國轉基因抗蟲棉品種迅速發展的10a，期間共有383個品種通過國家或者省級審定，其中通過國家審定的有107個，安徽審定16個[41]。截至2014年，我國總計有149個轉基因抗蟲棉品種通過國家審定，其中安徽省品種有7個，包括國豐棉12、諾華棉1號、荃銀2號、皖雜棉9號、金科棉98、綠億航天1號、屯豐棉6號。安徽省審定的轉基因棉花品種41個。我國轉基因棉花種植面積已占到棉花總面積的近80%，長江、黃河流域棉區抗蟲棉種植比例近100%，其中國產轉基因抗蟲棉市場占有率從1999年5%上升到2012年98%。

5 轉基因棉花產業化相關的問題

5.1 轉基因棉花的環境安全性 轉基因棉花是我國種植的面積最大的轉基因作物，人們看到商業化帶來巨大經濟利益的同時，也注意到其可能存在的潛在風險，其中生態安全問題已成為多方面關注的焦點。棉花環境安全的科學問題是：轉基因棉花的雜草化趨勢、基因漂移、靶標害蟲對轉基因棉花產生抗性、對土壤生物群落多樣性影響等。針對這些安全性問題，我國已經制定一系列安全性評價法規并組建了轉基因棉花環境安全風險分析與管理技術體系，形成了安全評價技術規范。

目前國際上對于轉基因作物以及產品檢測技術主要分為外源蛋白質測定和外源基因測定兩類。常用的外源蛋白質檢測方法有：試劑盒法、試劑條法、免疫印跡法（Western blot）和酶聯免疫法（ELISA）等。外源基因檢測技術主要分為定性檢測和定量檢測。定性檢測技術主要以聚合酶鏈式反應（PCR）和探針雜交為基礎，檢測手段有：一般PCR、巢式PCR及核算印記法等。定量檢測技術有：半定量PCR法和熒光定量PCR法等[42]。檢測流程為：第一步，篩選判斷是否含有轉基因成分；第二步，確定轉基因成分的性質；第三步，定量分析判定是否需要貼上識別標簽。

5.2 抗蟲棉種子真實性檢測 目前，棉花品種鑒定仍以形態鑒定為主，同時參考同工酶和種子貯藏蛋白電泳圖譜。但是形態標記受環境影響較大、周期長、工作量大，且同工酶和種子貯藏蛋白標記多態性不夠豐富。分子標記技術從DNA水平成為棉種鑒定技術新的發展趨勢。張小娟等[43]篩選獲得52對核心引物，對92分陸地棉骨干種質和3份亞洲棉骨干種質進行多樣性分析，揭示了不同種質間的遺傳差異，為棉花品種區別和鑒定提供了技術支持。匡猛等[44]、王飛等[45]比較了應用于棉花品種鑒定的4種分子標記—RFLP、RAPD、AFLP和SSR，分析得出SSR標記具有很高的多態性，其優越性非常適用于品種鑒定研究和DNA指紋圖譜的構建，為轉基因抗蟲棉種子真實性快速鑒定開辟新思路。寇偉等[46]利用卡那霉素處理探索出一個可以作為有效快捷的轉基因棉花室內篩選方案。

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（責編：張長青）