三種染色方法檢測凍融后兔卵巢組織的活力和質(zhì)量

劉麗英 曲文玉 孔剛 張曉麗 劉曉麗

三種染色方法檢測凍融后兔卵巢組織的活力和質(zhì)量

劉麗英 曲文玉 孔剛 張曉麗 劉曉麗

目的 建立一種簡單的評價冷凍前后卵巢組織活力與質(zhì)量的方法。方法 10只性成熟雌性大耳白兔，取卵巢組織制成皮質(zhì)片，隨機(jī)均分成2組（n=5）：新鮮組織和冷凍組織。臺盼藍(lán)、Calcein AM/EH及中性紅染色檢測分離卵泡的存活率并對卵巢組織中卵泡的存活情況進(jìn)行染色。激素釋放試驗檢測冷凍前后兔卵巢組織的功能。結(jié)果 應(yīng)用臺盼藍(lán)、Calcein AM/EH及中性紅對卵巢組織分離卵泡活力的評價效果相似；中性紅能較好的評價卵巢組織中卵泡的存活情況。經(jīng)冷凍解凍后，卵泡的活力下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；體外培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液E2水平不斷增加，培養(yǎng)12d后，E2濃度在新鮮及冷凍復(fù)蘇組織分別達(dá)1054、961pg/mL。孕酮水平分別為2.31、1.9ng/mL。結(jié)論 中性紅可有效地評價卵巢組織卵泡的活性；激素釋放試驗可以提供冷凍解凍卵巢組織存在活性的佐證。

冷凍保存；卵巢組織；臺盼藍(lán)；中性紅

卵巢是女性的性腺，其主要功能有：產(chǎn)生卵子并排卵的生殖功能及產(chǎn)生性激素的內(nèi)分泌功能。自然情況下，隨著年齡的增長，女性生殖能力逐漸下降是正常的、不可避免的。但對于患惡性腫瘤的女性患者(尤其是兒童和青春期前)來講，抗腫瘤治療：如大劑量化療和放療、婦科根治性手術(shù)治療(切除性腺)等都會對部分性腺功能產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，甚至是喪失，對患者的生活質(zhì)量和生殖能力造成嚴(yán)重的影響。目前已經(jīng)出現(xiàn)多種保存女性生育力的方法：一些團(tuán)隊試圖富集卵子進(jìn)行冷凍保存[1]，而其他一些團(tuán)隊則在卵巢冷凍方面進(jìn)行研究[2]。動物實驗表明，大鼠、小鼠及家兔的卵巢組織經(jīng)冷凍、解凍及自體移植能夠獲得妊娠[3-4]。同時卵巢的冷凍及自體移植還能夠恢復(fù)患者的內(nèi)分泌功能。

冷凍卵巢組織結(jié)構(gòu)的完整性及卵泡活力的評價方法有：組織學(xué)評價（光鏡及電鏡）及活細(xì)胞染色。卵巢組織功能的評價方法有激素釋放試驗及卵巢組織的移植試驗。本研究的目的在于應(yīng)用上述方法對兔的卵巢組織進(jìn)行冷凍前后的評價，以為人類的卵巢組織冷凍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 卵巢組織皮質(zhì)片的制備 4～5個月齡清潔級性成熟雌性大耳白兔10只，體質(zhì)量2～2.5kg，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。經(jīng)兔耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉溶液(2mL/kg)。麻醉動物后行下腹正中切口，切取卵巢組織。去除卵巢組織周圍的脂肪組織、系膜以及血漬，室溫下采用PBS液反復(fù)沖洗。用刀片切除髓質(zhì)部分，僅保留卵巢皮質(zhì)，切割成1mm×5mm×5mm大小的組織塊，整個切割過程15min內(nèi)完成，將組織分為新鮮組織（對照組）和冷凍組織（實驗組）。

1.2 卵巢組織的冷凍與解凍 卵巢組織塊裝入含6mL的卵巢冷凍液中（含10%胎牛血清、1.5mol/L乙二醇,PBS），4℃搖床平衡30min，裝入1.8mL的細(xì)胞凍存管，置于Planner程序降溫儀中。－2℃～－9℃，2℃/min，－9℃～－40℃，0.3℃/ min，－40℃～－140℃，－10℃/min，－9℃植冰，冷凍曲線保存于計算機(jī)中，凍存管轉(zhuǎn)移至液氮保存。

解凍：37℃解凍，依次經(jīng)過解凍液1、2、3（解凍液1含0.75M EG，0.25M S，PBS，10%胎牛血清；解凍液2含0.25M S，PSB，10%胎牛血清；解凍液3含PBS，10%胎牛血清）各10min，室溫輕輕震蕩，去除冷凍保護(hù)劑。

1.3 卵泡的分離及染色

1.3.1 卵泡的分離 將新鮮及冷凍解凍的卵巢組織移到Mcllwain切片機(jī)墊板上，切至卵巢組織大小約為0.5mm×0.5mm ×0.5mm。將切碎的卵巢組織移至含Liberase blendzyme（終濃度為0.04mg／mL）的50mL離心管中，37℃水浴中輕微震蕩60min，每10min用巴氏吸管輕輕吹打，胎牛血清終止消化反應(yīng)。懸濁液500轉(zhuǎn)，4℃離心10min，去上清，將沉渣轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，體式顯微鏡下觀察卵泡。用130μm內(nèi)徑的巴氏吸管將卵泡一個接一個吸出來，放在盛有含10%胎牛血清(FBS)的PBS的培養(yǎng)皿中，洗滌3次，將肉眼所見的間質(zhì)細(xì)胞全部去除。

1.3.2 臺盼藍(lán)試驗 卵泡應(yīng)用0.4%臺盼藍(lán)染色約1min。倒置顯微鏡下觀察（×400倍），卵泡中≥10%的顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞藍(lán)染為異常卵泡。卵母細(xì)胞不著色且僅＜10%的顆粒細(xì)胞著色表示為正常卵泡。

1.3.3 Calcein AM/Ethidium homodimer-1染色 在培養(yǎng)液滴中加入等體積的2×Calcein AM/Ethidium Homodimer-1工作液混勻，37℃避光染色45min，熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)波長/發(fā)射波長分別為（495/515nm）和（495/635nm）），觀察存活卵泡(綠色熒光)和死亡卵泡(紅色熒光)，計算存活卵泡的百分比。

1.3.4 中性紅染色 卵泡應(yīng)用15μg/mL的中性紅染色，倒置顯微鏡下觀察（×400倍），卵泡中卵母細(xì)胞及＞90%顆粒細(xì)胞著色的為存活卵泡。

1.4 卵巢組織中卵泡活性的染色 新鮮及冷凍復(fù)蘇的卵巢皮質(zhì)組織用組織切片機(jī)切割，將卵巢組織移到Mcllwain切片機(jī)墊板上，將卵巢組織切至泥狀，分別應(yīng)用臺盼藍(lán)、Calcein AM/ EH及中性紅進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下觀察。

1.5 激素釋放試驗 將冷凍前后的卵巢皮質(zhì)片轉(zhuǎn)移到含有l(wèi)mL卵泡培養(yǎng)液[含1%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒（Its），100mIU/mL的卵泡刺激素（FSH），10mIU/mL的黃體生成素（LH），5%胎牛血清（FCS）的α-MEM]的35mm培養(yǎng)皿中，37℃，5% CO2培養(yǎng)24h半量換液，收集培養(yǎng)液凍于-80℃冰箱中待用。解凍冷凍保存的培養(yǎng)液，采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定雌二醇及孕酮水平。試劑盒購買于德國羅氏公司，電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購買于瑞士Roche公司，按照試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。樣本率的比較采用Fisher's確切概率法或χ2檢驗。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 冷凍對卵巢組織內(nèi)分離卵泡的影響 在倒置顯微鏡下觀察，新鮮卵巢組織分離獲得的竇前卵泡大部分呈圓形或卵圓型，有完整的顆粒細(xì)胞層。卵母細(xì)胞位于卵泡的中間或略偏一側(cè)，鏡下表現(xiàn)為圓而明亮，胞質(zhì)均勻；顆粒細(xì)胞層周圍光滑。見圖1A。冷凍復(fù)蘇后的兔卵巢組織經(jīng)分離獲得的部分竇前卵泡與新鮮卵巢組織分離獲得的竇前卵泡形態(tài)相似，部分卵泡表現(xiàn)為顆粒細(xì)胞層模糊或破損，變形或崩解。卵母細(xì)胞色澤暗淡，模糊不清。見圖1B。

卵泡經(jīng)雙熒光染色后，在藍(lán)光的激發(fā)下，活細(xì)胞顯示綠色熒光，死亡細(xì)胞顯示紅色熒光；卵泡經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，藍(lán)染的為死亡卵泡，不著色的為存活卵泡；卵泡經(jīng)中性紅染色后紅染的為存活卵泡，不著色的為死亡卵泡。見圖2。冷凍前后卵泡存活率的比較見表1。

表1 冷凍前后兔分離卵泡的存活率比較

3種染色方法對冷凍前后兔卵巢組織分離卵泡的染色結(jié)果提示，臺盼藍(lán)、Calcein AM/EH與中性紅給出了相似的卵泡存活率，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。冷凍復(fù)蘇組織的卵泡存活率低于新鮮組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，可見在冷凍及卵泡分離過程中受到一定的損傷。

圖1 分離冷凍前后竇前卵泡的形態(tài)

圖2 3種染色方法進(jìn)行分離卵泡的染色結(jié)果

2.2 卵巢組織中卵泡活性的檢測結(jié)果 卵巢組織中卵泡的染色結(jié)果顯示，臺盼藍(lán)僅能檢測死亡卵泡的情況，不能檢測卵巢組織中存活卵泡的數(shù)量，不利于移植前卵泡狀態(tài)的評估。Calcein AM/EH不能檢測卵巢組織中卵泡的存活情況，中性紅作為活細(xì)胞染料可以很好的檢測卵巢組織中卵泡的存活情況，有利于移植前的卵巢組織卵泡狀態(tài)的評價。見圖3。

圖3 中性紅檢測卵巢組織中卵泡的存活情況

2.3 激素釋放試驗 為了排除卵泡培養(yǎng)液內(nèi)存在相關(guān)激素的可能性，對新鮮的卵泡培養(yǎng)液的激素水平進(jìn)行測定：17-β雌二醇（E2）＜10pg/mL，孕酮＜0.1ng/mL。卵巢皮質(zhì)片經(jīng)培養(yǎng)12d后，其E2濃度在新鮮及冷凍復(fù)蘇組織分別達(dá)1054、961pg/ mL。孕酮水平分別為2.31、1.9ng/mL。見圖4。

3 討論

放療和化療技術(shù)的進(jìn)展，極大地提高了年輕腫瘤患者的生存率，然而這些治療對生育力的影響是致命的[5]。由于社會及經(jīng)濟(jì)因素的影響，目前選擇晚育的女性不斷增加,因此在診斷為腫瘤時，要求保存生育力的育齡婦女?dāng)?shù)量不斷增加。卵巢組織的冷凍保存對于生育力保存是一個很有前景的方法[6]，它不需要卵巢刺激和供精；卵巢組織冷凍對于青春期前的女孩是僅有的一種生育力保存方法；同樣也適用于不能接受卵巢刺激而推遲腫瘤治療的單身女性。在這一過程中，卵巢組織通過外科手術(shù)切除，去除髓質(zhì)及黃體，僅留薄薄一層皮質(zhì)（約1mm）冷凍保存。經(jīng)過冷凍，大多數(shù)存活下來的卵泡是小的原始卵泡，這些原始卵泡代謝不旺盛，缺少透明帶、紡錘體和皮質(zhì)顆粒細(xì)胞，比成熟的卵泡較易耐受冷凍損傷，是卵巢組織冷凍保存的主要對象。事實上，卵巢組織冷凍保存已開始被作為一種治療手段。但它仍然存在很多的問題：一個主要問題是如何簡單地評價冷凍卵巢組織的活力和質(zhì)量。本研究應(yīng)用3種染色方法檢測凍融前后兔卵巢組織分離卵泡的存活率、激素水平測定評價卵泡的功能。

圖4 冷凍前后分離卵泡經(jīng)體外培養(yǎng)E2及孕酮值的變化

目前卵巢組織尚無公認(rèn)的冷凍方案，將凍融后的卵巢組織分離出單個卵泡并檢測其活性，能夠間接檢驗冷凍方案是否達(dá)到滿意的冷凍效果。本研究主要比較3種染色方法（臺盼藍(lán)、Calcein AM/EH-1、中性紅）對分離卵泡活力的檢測能力。臺盼藍(lán)作為一種排除實驗，不穿透細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞，而能通過死亡卵泡的卵泡膜使卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞染色。鈣黃綠素(Calcein AM)/溴乙非啶同型二聚體(Ethidium homodimer-1，EH-1)雙熒光染色是目前公認(rèn)的檢測卵泡的存活狀況的指標(biāo),Ethidium homodimer 1能插入DNA中，將膜溶解卵泡的細(xì)胞核染成紅色，Calcein AM是非熒光物質(zhì)，但通過細(xì)胞膜后，被溶酶體內(nèi)的細(xì)胞酯酶轉(zhuǎn)化為強(qiáng)熒光物質(zhì)Calcein，產(chǎn)生綠色熒光。因此通過對于卵泡的Calcein AM/EH-1的雙熒光染色，可以判斷卵泡是否存活。中性紅能夠穿透細(xì)胞膜，將膜完整的細(xì)胞染成紅色。這3種方法給出了冷凍前后活力的比較，組織學(xué)評價確證了這一結(jié)果。本研究結(jié)果表明，臺盼藍(lán)與中性紅提供了與CalceinAM/ EH-1相同的信息，而價格卻是它的1/100。卵巢皮質(zhì)片中卵泡的染色結(jié)果顯示，臺盼藍(lán)及Calcein AM/EH不能檢測卵巢組織中卵泡的存活情況，中性紅作為活細(xì)胞染料可以很好地檢測卵巢組織中卵泡的存活情況，有利于對移植前卵巢組織存活卵泡的數(shù)量進(jìn)行評價。

本研究結(jié)果顯示，新鮮卵巢組織的卵泡存活率為84.2%，考慮仍有部分卵泡在前期運(yùn)輸，修整卵巢組織塊時的機(jī)械切割和擠壓及分離卵泡過程中使得卵巢組織中的部分卵泡損傷。

冷凍復(fù)蘇后培養(yǎng)卵巢皮質(zhì)片的激素活性測定是評價冷凍方案有效性的一個標(biāo)準(zhǔn)。眾所周知，卵巢組織生成類固醇的活性是卵巢活性的一個附加指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，新鮮培養(yǎng)組和冷凍復(fù)蘇培養(yǎng)組均有E2的分泌，E2的產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時間的延長而增高，提示凍融后組織具有體外發(fā)育潛力，并保持了一定的內(nèi)分泌功能，本研究的結(jié)果與文獻(xiàn)報道的相似[7]。但需要指出的一點是：我們培養(yǎng)的是卵巢皮質(zhì)片，而不是分離的卵泡，所以類固醇產(chǎn)生不僅僅反映卵泡的發(fā)育情況，有研究表明[8]，取自絕經(jīng)期卵巢皮質(zhì)片中增生的基質(zhì)細(xì)胞也能在在體或離體的情況下產(chǎn)生E2。Isachenko等[9]應(yīng)用玻璃化冷凍和體外培養(yǎng)人的卵巢皮質(zhì)片發(fā)現(xiàn)，盡管在新鮮和培養(yǎng)的皮質(zhì)片中沒有檢測到卵泡,孕酮的水平仍然與對照組一樣高。因此冷凍卵巢組織的內(nèi)分泌功能與生殖功能之間的關(guān)系值得進(jìn)一步的研究。

冷凍卵巢組織的主要目的是自體移植后恢復(fù)患者的生育能力及內(nèi)分泌功能。那么，移植前正確評價冷凍組織卵泡的存活及內(nèi)分泌功能是至關(guān)重要的。本研究表明，應(yīng)用便宜的染料臺盼藍(lán)和中性紅染色可以評價分離卵泡的活力，同時中性紅也可直接用于卵巢皮質(zhì)片中存活卵泡的染色，更適用于移植前卵泡活力的檢測。激素釋放試驗可以間接地檢測卵泡的功能，提供冷凍效果的信息。

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Objective To establish a simple evaluated methods to assess the vitality and quality of ovarian tissue after freezing-thawing procedures. Methods Ovarian tissues from 10 female rabbits were randomly divided into two groups: fresh group and frozen group. The follicles viability were assessed by trypan blue staining,calcein AM/ethidium homodimer-1 staining and neutral red staining. The function of ovarian tissues were detected by hormone-releasing assays. Results Trypan blue, Calcein AM/EH and neutral red staining have the similar results about ovarian follicle viability assessment. The viability of follicles decreased after freezing and thawing (P＜0.05); E2and Progesterone levels increased after cultured 12 days. The supernatants showed 17-βestradiol concentrations of 1054 and 961pg/mL, and progesterone concentrations of 2.31 and 1.9ng/ mL respectively in fresh and frozen groups. Conclusion Neutral red staining can effectively evaluate the follicle viability; Hormone-releasing test can provide the evidence that the freezing-thawing ovarian tissue has higher developmental potential.

Cryopreservation; Human ovarian tissue; Trypan blue; Neutral red

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.27.001

沈陽市科委項目(F14-158-9-13)

遼寧 110014 沈陽市婦嬰醫(yī)院生殖中心 （劉麗英 曲文玉 孔剛張曉麗 劉曉麗）