Axl和Mer受體調控小鼠紅細胞分化

唐紅梅，賈長虹，李巍偉，李 明

(華北理工大學 生命科學學院， 河北 唐山 063000)

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研究論文

Axl和Mer受體調控小鼠紅細胞分化

唐紅梅*，賈長虹，李巍偉，李 明

(華北理工大學 生命科學學院， 河北 唐山 063000)

目的研究Axl和Mer受體是否參與紅細胞分化的調控。方法單基因(AXL-/-和MER-/-)和雙基因(AXL-/-MER-/-)敲除小鼠，利用組織切片觀察小鼠骨髓、肝臟和脾臟的組織結構；計數小鼠單根股骨內骨髓細胞的數量；用實時定量PCR檢測與紅細胞分化相關基因mRNA的表達。結果雙基因敲除的小鼠單根股骨骨髓內總細胞、單個核細胞和成熟紅細胞的數量分別下降了40%、34%和53%(P<0.01)；骨髓細胞排列稀疏，血竇內、外成熟紅細胞數量明顯減少；雖然外周血中紅細胞數量和血紅蛋白的含量沒有改變，但存在著明顯的髓外造血，肝臟里出現了造血島，脾臟中紅髓明顯地增生。而單基因敲除小鼠骨髓中紅細胞數量以及組織結構未見改變。且雙基因敲除小鼠中紅系細胞內GATA- 1和EpoR的mRNA表達分別降低了65%和75%(P<0.01)。結論Axl和Mer受體通過GATA- 1和EpoR來調節紅細胞的分化，并且功能上存在重疊、過剩和代償。

Axl；Mer；基因敲除；紅細胞分化

哺乳動物紅細胞的生成是造血干細胞在造血微環境中增殖、分化、成熟和釋放的復雜過程。在此過程中，細胞要接受多種生長因子、受體的調控，同時有多條信號通路的參與。TAM受體是Tyro3、Axl和Mer 3個受體的簡稱，是一個發現較晚的受體酪氨酸激酶亞家族。這3個受體分子結構相似，都是單次跨膜蛋白，由細胞黏附分子相關的胞外配體結合域、跨膜區和有酪氨酸激酶結構域的胞內區組成，所以TAM受體既具有黏附分子的特點，又具有酪氨酸激酶活性[1]。TAM受體廣泛表達于生理及病理狀態下的免疫[2]、神經[3- 4]、生殖[5- 6]、造血[7]等系統的細胞中，具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和介導細胞黏附、識別、吞噬凋亡細胞等作用[8]。在血液中，它們參與巨核細胞[9]、NK細胞[10]和DC細胞[11]的分化，調節止血和天然免疫。而在紅系細胞內共表達Axl和Mer，不表達Tyro3受體[12]，故本研究以基因敲除小鼠為研究對象，探討Axl和Mer受體對紅細胞分化的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

AXL-/-(簡稱A)、MER-/-(簡稱M)單基因敲除小鼠(美國加州Salk生物研究院分子神經生物學實驗室Lemke博士和盧清顯博士惠贈)；AXL-/-MER-/-(簡稱AM)雙基因敲除小鼠由單基因敲除小鼠配種繁育而成。正常C57BL/6小鼠(Wild Type，簡稱WT)[中國醫學科學院實驗動物研究所，合格證號SCXK(京)2004- 0001]。實驗小鼠的年齡是10～15周，雌雄兼有。

1.2 試劑

HE染色試劑盒、紅細胞裂解液(碧云天生物公司)；PBS緩沖液(中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心)；Trizol(Invitrogen 公司)；實時定量PCR(quantitative real time PCR，qPCR)引物(北京賽百盛生物公司)；qPCR試劑盒(Applied Biosystems公司)；Anti-Ter119-PE抗體、Anti-PE超微磁珠(BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 免疫磁珠法分離Ter119+細胞：含有0.5%血清白蛋白、0.08% EDTA、pH值為7.2的PBS(簡稱PBE)作為孵育液。用PBE懸浮待分離骨髓細胞，加入適量的anti-Ter119-PE抗體混勻，4 ℃孵育30 min后清洗細胞；再加入適量的anti-PE抗體包被的超微磁珠混勻后，置室溫孵育10～15 min；安裝分離柱于磁場中，預處理分離柱；將孵育的細胞懸液注入分離柱中，自然下流，并清洗分離柱兩次；取出分離柱，注入PBE，收集細胞。

1.3.2 qPCR：提取紅系細胞中RNA進行qPCR反應，以β-actin做內參。qPCR擴增反應50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃ 1 min×40次，總反應體積為20 μL。使用ABI PRISM 7000實時定量PCR儀進行基因擴增。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 AM小鼠骨髓組織結構的改變

WT小鼠股骨內的骨髓細胞排列緊密，組織內含豐富的血竇，竇內充滿成熟的紅細胞。而AM小鼠骨髓內造血細胞排列稀疏，竇內、外成熟紅細胞數量明顯減少。但是A和M小鼠骨髓組織結構未見異常(圖1)。

2.2 AM小鼠骨髓內總細胞和成熟紅細胞數量減少

AM小鼠的總骨髓細胞數量和單個核細胞數量分別減少了40%和34%(P<0.01)。而且與骨髓組織切片觀察到的結果相一致，AM小鼠骨髓內成熟紅細胞的數量下降非常嚴重，只有WT小鼠的47%(P<0.01)(表1)。

2.3 AM小鼠外周血中紅細胞形態結構、數量和血紅蛋白含量正常

AM小鼠外周血中的紅細胞(RBC)數量、血紅蛋白(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白(MCH)和平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)等指標未見異常。血涂片檢查AM小鼠紅細胞的形態結構亦未見改變。但是老年(大于9月齡)AM小鼠出現嚴重貧血(表2)，紅細胞的數量和血紅蛋白含量只有WT小鼠的1/2左右(P<0.01)；紅細胞壓積亦降低了29%(P<0.05)。

Arrows point sinusoid(scale bar=20 μm)

grouptotalcellsnucleatedcellsredcellsWT271±006192±018078±002A269±009175±016072±002M272±010179±012087±003AM163±004?126±014?037±003?

*P<0.01 compared with WT group.

表2 各種基因型老年小鼠血液中紅細胞的參數

*P<0.05,**P<0.01 compared with WT group.

2.4 AM小鼠出現髓外造血

AM小鼠的肝臟和脾臟腫大，且脾臟腫大更明顯。AM小鼠脾臟的平均重量是WT小鼠的3.5倍(圖2A)，肝臟的平均重量是WT小鼠的0.3倍(圖2B)。不過M小鼠的脾臟亦出現腫大。AM小鼠肝組織中有許多巨核細胞和成團的造血島；脾組織中可見紅髓增生甚至侵潤到白髓中、血竇擴張充血、單位面積中的巨核細胞數量明顯增加。

A.splenic weight of mice; B.liver weight of mice; *P<0.05, **P<0.01 compared with WT group

2.5 AM小鼠紅系細胞內GATA- 1和EpoR表達量明顯降低

AM小鼠骨髓紅系細胞中GATA- 1和EpoR表達量明顯降低，分別是WT小鼠的1/3和1/4(P<0.01)(圖3)。

*P<0.01 compared with WT group圖3 紅系細胞中與紅細胞分化相關分子的mRNA的差異表達Fig 3 Relative mRNA levels analyzed by quantitative real time PCR in the sorted erythroid cells from

3 討論

本實驗利用基因敲除小鼠做為實驗動物，有效地反映了Axl和Mer受體對紅細胞生成的影響。單基因敲除的A和M小鼠骨髓內成熟紅細胞數量正

常，但是雙基因敲除的AM小鼠骨髓內成熟紅細胞數量下降了50%，這說明Axl和Mer受體均參與了紅細胞分化的調控。這與TAM受體調控巨核細胞分化[9]和精子發生[5- 6]的作用相似，幾個受體共表達在同一細胞時，功能上往往出現了重疊、過剩和代償。

雖然AM小鼠由于髓外造血的補償作用未出現貧血，但是隨著年齡的增長，受損的骨髓造血功能無法逆轉，肝、脾臟代償造血的能力達到極限，就會失代償而出現嚴重的貧血。AM小鼠壽命的縮短，只有WT小鼠的1/2～2/3倍，這可能與機體后期嚴重的貧血相關。

GATA- 1是紅細胞分化必需的特異性轉錄調節因子。GATA- 1基因敲除后發現，小鼠的胚胎會在中期死亡，紅系分化停止在成紅細胞階段[13]。Epo亦是調控紅細胞分化的重要細胞因子。Epo基因敲除后，小鼠的胚胎將在發育中期死亡，其受體是EpoR、Epo與EpoR結合后可誘導細胞內多條信號途徑[14]，從而調控紅細胞發育。本實驗結果表明，AM小鼠骨髓的紅系細胞內GATA- 1和EpoR表達明顯下降，因此推測Axl和Mer受體可能通過調控GATA- 1和EpoR的表達來調節紅細胞分化，但是作用到紅細胞分化的階段和信號通路并不清楚，有待于深入研究。

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新聞點擊

女性每周吃兩次魚可降低抑郁風險

據英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2014- 05- 05報道，最新研究顯示，吃魚能夠趕走抑郁，可惜的是，這只對女性有用。

研究人員發現，女性每周至少食用兩次海鮮，能降低25%抑郁風險。但多吃魚恐無助男性遠離抑郁。研究人員推測，大量Omega- 3脂肪酸可能會和女性雌激素以及黃體激素結合，讓腦部維持正常運作。

澳大利亞塔斯馬尼亞(Tasmania)孟席斯研究院(Menzies Research Institute)研究團隊追蹤超過1 400名年齡介于26～36歲的男性和女性，時間長達5年。

這些受試者將每日飲食內容記錄下來，包括魚類、蝦和貽貝等多種海鮮，研究人員同時也進一步追蹤調查他們的心理健康。盡管將吸煙、體質量、運動、飲酒、教育及就業情況等生活因素列入考慮后，研究人員仍發現吃魚和抑郁發生率之間有著強烈關聯。

這項研究刊登在《美國流行病學期刊》(AmericanJournalofEpidemiology)。

美甲燈有輕微癌癥風險

據美國WebMD醫學新聞網(2014- 04- 27)報道，傳統修指甲美容院是將剛涂好的指甲放在一個燈下面烘干，這種美甲燈會放射紫外線A(UVA)，長期接觸與皮膚癌有關。但有篇最新研究指出，以平均到美甲店的次數計算，致癌的可能性不大。

刊登在2014- 04- 30《美國醫學協會皮膚學期刊》(JAMADermatology)的研究結果顯示，考慮到一般人到美甲店所接觸的UVA不多，出入頻繁的人則可能會達到DNA受損的閾值，刺激癌細胞生長。

專家指出，不同制造商生產的美甲燈的功率以及發光度都有極大的不同，在美甲店內使用這些燈的人，無法知道在每次幫客人護甲時，皮膚到底會接觸多少UV。

紐約大學Langone醫學中心的皮膚學助理教授Chris Adigun博士認為，客人在使用美甲燈時，應該穿戴一些抗UV的遮擋物。

身高較矮較長壽

據英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2014- 05- 12報道，體型矮小男子比高大男子更長壽，研究追蹤8 000多名1900至1919年出生的日裔美籍男子。身高不到158 cm的男性最長壽，科學家發現，個子矮小可能與擁有長壽相關基因有關。

一項針對8 000名男子的研究報告發現，身高較矮男子，活得比身材魁梧者更長，身高不到158 cm男子最長壽。

研究稱，一種保護性基因FoxO3，會在早期發育階段讓身材變得矮小，但也可能意味壽命更長。個子較小的男子，血液中的胰島素濃度也可能較低，且一生中較不易罹患癌癥。

夏威夷大學(University of Hawaii)魏寇克斯(Bradley Willcox)教授認為：“我們將實驗者分成兩組，一組是身高158 cm以下的人，而另一組是身高163 cm以上的人。”

結果顯示，對于身高介于152.4～182.9 cm的男性，158 cm以下的男子最長壽。身材愈高，壽命就愈短。

魏寇克斯說：“這項研究首度證明體型與FoxO3基因有關。”

這篇研究報告發表于《公共科學圖書館期刊》(PLoSOne)。

Axl and Mer receptors regulate erythropoiesis in mice

TANG Hong-mei*, JIA Chang-hong, LI Wei-wei, LI Ming

(College of Life Science, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China)

Objective To study whether the Axl and Mer receptors are involved in the regulation of erythroid differentiation. Methods Single and double mutant mice for AXL and MER were used in the research. Histological sections of bone marrows, livers and spleens, cellularity of bone marrow, hematologic parameters, and the expression of erythroid factors were analyzed to evaluate the function of Axl and Mer in erythropoiesis. Results Histological analysis showed that the sinusoids in wild-type bone marrows were filled with red blood cells, whereas those in theAXL-/-MER-/-bone marrows were largely empty and contained fewer red blood cells. The number of the total cells, the nuclearted cells and the red blood cells in anAXL-/-MER-/-femur were decreased. A compensatory extramedullary erythropoiesis occurred inAXL-/-MER-/-mice. The hematopoietic islands appeared in the liver, and the red pulp is expanded in the spleen. Mice lacking single AXL or MER exhibited normal erythropoiesis in steady-state conditions. The relative mRNA levels of EpoR and GATA- 1 were significantly down-regulated inAXL-/-MER-/-erythroid cells.Conclusions Axl and Mer receptors may influence erythropoiesis through the regulation of GATA- 1 and EpoR expression in erythroid cells.

Axl; Mer; gene knockout; erythropoiesis

2015- 06- 03

2015- 09- 28

河北省自然科學基金(H2013209194)

1001-6325(2015)12-1628-05

R331.1

A

*通信作者(corresponding author)：thmyouxiang@163.com