SIRT1激活ERK1/2通路抑制大鼠心肌缺血再灌注時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)

吳 倩，劉新偉

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科， 重慶 400016)

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研究論文

SIRT1激活ERK1/2通路抑制大鼠心肌缺血再灌注時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)

吳 倩，劉新偉*

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科， 重慶 400016)

目的研究大鼠心肌缺血再灌注時沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)對心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的影響及其與ERK1/2信號通路的關(guān)系。方法將大鼠隨機分為6組：假手術(shù)組、缺血再灌注組、白藜蘆醇+缺血再灌注組、白藜蘆醇+EX527+缺血再灌注組、白藜蘆醇+PD98059+缺血再灌注組、PD98059+缺血再灌注組，每組12只。結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支建立大鼠心肌I/R損傷模型。 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡；比色法檢測LDH、CK-MB活性。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測心肌GRP78、caspase-12和CHOP mRNA的表達(dá); Western印跡檢測SIRTl、caspase-12、CHOP、磷酸化ERK1/2和總ERK1/2蛋白的表達(dá)。結(jié)果Res+I/R組與I/R組相比，心肌凋亡指數(shù)降低(P<0.05)，血清LDH及CK-MB活性降低，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的指標(biāo)GRP78、caspase-12及CHOP的蛋白表達(dá)量和mRNA均降低(P<0.05);給予SIRT1抑制劑后與Res+I/R組相比，以上指標(biāo)升高；Res+I/R組與I/R組相比，SIRT1及磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)量均增加(P<0.05);而Res+EX+I/R組與Res+I/R組相比，SIRT1、磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)量又降低(P<0.05)。結(jié)論SIRT1能夠抑制大鼠在體缺血再灌注心肌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，發(fā)揮保護心肌的作用，其機制可能與ERK1/2通路激活有關(guān)。

沉默信息調(diào)節(jié)；心肌缺血再灌注損傷；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；凋亡；ERK1/2通路

心肌缺血再灌注損傷是急性心肌梗死后溶栓療法、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、體外循環(huán)術(shù)后心肌損傷的重要機制之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡已被證實參與了心肌缺血再灌注損傷[1]，并且其途徑不同于經(jīng)典的線粒體凋亡途徑和死亡受體途徑，所以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡無疑是減輕心肌缺血再灌注損傷的有效方法。目前研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血預(yù)處理[2]與后處理[3]都能減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡，但鑒于這些方法在臨床運用中的局限性，提示需要找到新的靶點抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡。

研究證實沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)能夠有效減輕缺血再灌注損傷，但在心肌缺血再灌時，SIRT1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑的影響還未見報道，本研究觀察大鼠心肌缺血再灌注時，SIRT1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白的影響及其對ERK信號通路的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組及模型建立:雄性SPF級SD大鼠72只，體質(zhì)量200～250 g[重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，質(zhì)量合格證編號：NO.0002699，生產(chǎn)許可證編號：SCXK(渝)2012- 0001]。隨機分為6組：假手術(shù)組(control)、缺血再灌注組(I/R)、白藜蘆醇+缺血再灌注組(Res+I/R)、白藜蘆醇+EX527+缺血再灌注組(Res+EX+I/R)、白藜蘆醇+PD98059+缺血再灌注組(Res+PD+I/R)、PD98059+缺血再灌注組(PD+I/R)，每組12只。Control組：僅開胸，于大鼠左冠狀動脈前降支根部穿線但不結(jié)扎；I/R組：結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支，結(jié)扎30 min后再灌注120 min；Res+I/R組：白藜蘆醇溶于10 mg/kg分別于缺血前15 min及再灌注前1 min尾靜脈給藥；Res+EX527+I/R組：白藜蘆醇加藥情況同前，分別于缺血前15 min及再灌注前1 min尾靜脈給藥EX527 1 μg/kg；Res+PD98059+I/R組：Res加藥情況同前，PD98059 0.3 mg/kg于缺血前10 min尾靜脈注射；PD98059+I/R：PD98059加藥情況同前。

1.1.2 主要試劑:白藜蘆醇、PD98059和EX527(Sigma公司)；TUNEL試劑盒(Roche公司)；兔抗大鼠caspase-12抗體(Millipore公司)；兔抗大鼠CHOP(GADD153)抗體(Santa Cruz公司)；兔抗鼠SIRT1抗體、ERK1/2抗體、磷酸化ERK1/2(T202/Y204)抗體，β-actin和二抗(Immunoway公司)；實時熒光定量PCR的Trizol試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡:實驗結(jié)束后，立即取各組大鼠心尖部位心肌常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片。按TUNEL檢測試劑盒操作。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行凋亡細(xì)胞計數(shù)。心肌細(xì)胞凋亡率即凋亡指數(shù)(AI)=凋亡心肌細(xì)胞核數(shù)/心肌細(xì)胞核總數(shù)×100%。

1.2.2 心肌酶測定:大鼠再灌注120 min后，經(jīng)左頸動脈取血樣2 mL，3 500 r/min離心10 min，取上清液，采用比色法檢測清乳酸脫氫酶(LDH)和MB型肌酸激酶同工酶(CK-MB)的活性。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測GRP78、caspase-12及CHOP mRNA的表達(dá):利用Trizol法按說明書提取目的細(xì)胞總RNA，Thermo濃度測定儀測RNA濃度后-80 ℃保存。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，測濃度后-20 ℃保存。各組cDNA利用CFX96擴增儀分別擴增各目的基因。擴增條件為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s，56～60 ℃不等退火30 s,72 ℃延伸10 min,共35個循環(huán)。以2-ΔΔCT計算所得結(jié)果。各目的基因引物列如下：GRP78正義鏈：5′-AACCCAGATGAGG CTGTAGCA-3′,反義鏈：5′-ACATCAAGCAGAACCAG GTCAC-3′。β-actin正義鏈：5′-ACGGTCAGGTCACT ATCG-3′,反義鏈：5′-GGCATAGAGGTCTTTACGGA TG-3′。Caspase-12正義鏈：5′-TTGGAAGGTAGGCA AGAGTGG-3′，反義鏈：5′-TCAATGGTGGGCATCTGG GTC-3′。CHOP正義鏈：5′-AGCTGAGTCTCTGCCTT TCG-3′, 反義鏈：5′-TGTGGTCTCTACCTCCCTGG-3′。

1.2.4 Western blot法檢測SIRT1、CHOP、caspase-12、磷酸化-ERK1/2、總-ERK1/2的蛋白表達(dá)：取各組大鼠心尖部位心肌，經(jīng)勻漿器研碎。加裂解液，離心后吸取上清液，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。各標(biāo)本取50 μg行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液室溫封閉后分別加入一抗和二抗。加人ECL試劑，暗室曝光，顯影、定影。電泳成像系統(tǒng)定量掃描分析,結(jié)果以目的基因/內(nèi)參吸光度比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心肌組織TUNEL染色結(jié)果

與假手術(shù)組比較，其余各組心肌凋亡指數(shù)均增加(P<0.05)。與I/R組相比，Res+I/R組顯著降低，PD98059+I/R組顯著升高(P<0.05)；加入SIRT1和ERK的阻斷劑后，與Res+I/R組相比，Res+EX527+I/R組和Res+PD98059+I/R組明顯升高(P<0.05)(圖1，2)。

2.2 血清中LDH及CK-MB活性

與假手術(shù)組比較，各組LDH及CK-MB的活性均增加(P<0.05)。與I/R組相比，Res+I/R組顯著降低，PD98059+I/R組顯著升高(P<0.05)；與Res+I/R組相比，Res+EX527+I/R組和Res+PD98059+I/R組LDH、CK-MB的活性又回升(P<0.05)(表1)。

2.3 組織GRP78、caspase-12及CHOP mRNA的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，其余各組GRP78、caspase-12及CHOP mRNA的表達(dá)量均增加(P<0.05)。與I/R組相比，Res+I/R組顯著降低， PD98059+I/R組顯著升高(P<0.05)；與Res+I/R組相比，Res+EX527+I/R組及Res+PD98059+I/R組明顯升高(P<0.05)(圖3)。

圖1 各組心肌組織TUNEL染色結(jié)果

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group; ΔP<0.05 compared with R+I/R group圖2 各組心肌凋亡指數(shù)(AI)的變化Fig 2 The changes of apoptosis index of each

groupLDHCK-MBcontrol487±38354±31I/R990±63*877±48*R+I/R602±55#580±54#R+E+I/R724±54Δ720±30ΔR+PD+I/R762±30Δ723±67ΔPD+I/R1155±43#1037±71#

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with I/R group;ΔP<0.05 compared with R+I/R group.

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group; ΔP<0.05 compared with R+I/R group圖3 各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)GRP78、caspase-12、CHOP mRNA表達(dá)的變化Fig 3 The mRNA expression of ERS related marker GRP78, caspase-12 and CHOP of each

2.4 心肌組織caspase-12及CHOP蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組相比，其余各組cleaved-caspase 12 及CHOP蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。與I/R組相比，Res+I/R組表達(dá)量顯著降低，PD98059+I/R組表達(dá)量升高(P<0.05)；與Res+I/R組相比，Res+EX527+I/R組和Res+PD98059+I/R組均明顯升高(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with I/R group;ΔP<0.05 compared with R+I/R group圖4 各組心肌caspase-12及CHOP 蛋白表達(dá)量的變化Fig 4 The changes of caspase-12 and CHOP protein

2.5 心肌組織SIRT1蛋白表達(dá)、磷酸化-ERK1/2與總-ERK1/2蛋白的表達(dá)的比值

SIRT1與p-ERK蛋白的表達(dá)趨勢相同。與I/R組相比SIRT1、p-ERK蛋白表達(dá)量較 Res+I/R組顯著增加，用SIRT1特異性抑制劑EX527后，兩者表達(dá)量均降低(圖5)。

*P<0.05 compared with control group(Co); #P<0.05 compared with I/R group; ΔP<0.05 compared with R+I/R group圖5 各組SIRT1和磷酸化-ERK1/2/總-ERK1/2表達(dá)量的變化Fig 5 The SIRT1 protein expression and the ratio of p-ERK1/2 to t-ERK1/2 changes of each

3 討論

SIRT1能夠減輕氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)[4]，激活心肌細(xì)胞自噬[5]，還能夠抑制缺血再灌注所致心肌細(xì)胞凋亡[6- 7],保護心肌。白藜蘆醇是SIRT1的有效激動劑，而EX527為SIRT1的特異性抑制劑。本結(jié)果顯示白藜蘆醇可降低心肌細(xì)胞的凋亡率， EX527可增加凋亡率，表明SIRT1能夠有效的抑制細(xì)胞凋亡。

近來在被誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的HepG2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SIRT1能夠減輕肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[8- 9]。心肌缺血再灌注的過程消耗大量的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，釋放大量的氧自由基和炎性因子，也會激活心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑。本實驗運用SIRT1激動劑與抑制劑， 觀察在體心肌缺血再灌注時SIRT1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP78、caspase-12和CHOP的mRNA及蛋白表達(dá)量隨SIRT1的激活而降低，隨SIRT1的抑制而升高。Caspase-12和CHOP兩條促凋亡通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡的兩條重要的途徑，caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有的促凋亡蛋白酶，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生，無活性的pro-caspase-12被激活后形成cleaved-caspase- 12,繼而激活caspsse- 3[10]。CHOP/GADD153是ERS促凋亡的堿性亮氨酸拉鏈的轉(zhuǎn)錄因子，它通過下調(diào)凋亡抑制因子Bcl- 2的表達(dá)、增加氧化等機制導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。結(jié)果充分表明SIRT1還能夠通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)，保護缺血再灌注心肌。

本實驗還進一步探索了SIRT1抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡中ERK1/2的作用。ERK1/2通路是再灌注損傷挽救激酶信號通路(reperfusion injury survival kinase,RISK)之一。心肌缺血再灌注時，磷酸化的ERK1/2能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，使心肌細(xì)胞凋亡減少，產(chǎn)生心肌保護作用[11]。本實驗結(jié)果也顯示抑制ERK1/2的會增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)，與之前研究相符。有報道SIRT1能促進磷酸化ERK1/2表達(dá)增加，對心肌細(xì)胞起保護作用[12]，推測ERK1/2信號通路參與了SIRT1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的作用。因此本實驗采用SIRT1的激動劑和抑制劑來觀察兩者的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇促進了ERK1/2磷酸化，抑制caspase-12和CHOP的表達(dá)，而EX527的作用則相反，說明大鼠心肌缺血再灌注中ERK1/2通路是SIRT1抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的下游靶點之一。綜上所述，本結(jié)果證實SIRT1能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，并且其機制可能是通過激活ERK1/2通路而實現(xiàn)的。

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SIRT1 inhibits related protein expression of endoplasmic reticulum stress in myocardial ischemic/reperfusion by activation of ERK1/2 pathway in rat

WU Qian, LIU Xin-wei*

(Dept. of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

Objective To investigate the role of silent information regulator 1 on endoplasmic reticulum dependent apoptosis pathway induced by myocardial ischemic reperfusion and the relationship with ERK1/2 pathway.MethodsRats were divided into 6 groups: control group,ischemic/reperufuison group,resverotrol treatment group, resverotrol plus EX527(1 μg/kg) treatment group, resverotrol (10 mg/kg)plus PD98059 (0.3 mg/kg) treatment group,PD98059 treatment group,each groupn=12.The myocardial I/R injury model in rats was established by ligating left anterior descending coronary artery.TUNEL method was used to detect myocardial apoptosis; Colorimetric method was used to measure LDH and CK-MB activity.qRT-PCR was used to detect the myocardial mRNA expression of GRP78,caspase-12 and CHOP; The protein expression of sirt1,caspase-12,CHOP, phosphor-ERK1/2 and total ERK1/2 were measured by westernblot.Results Compared with I/R group,the myocardial cell apoptosis index,LDH and CK-MB activity,mRNA expression of GRP78,caspase-12,CHOP and the protein expression of caspase-12,CHOP decreased while the protein expression of SIRT1 and phosphor-ERK1/2 increased in resveratrol treatment group.Then treated with SIRT1 inhibitor EX527 in Res+EX+I/R group the increase or decrease result of those index were conteracted compared with Res+I/R group. Conclusions SIRT1 can protect heart from ischemic reperfusion injury through inhibiting ER-dependent apoptosis protein expression,the mechanism of which is partly related with ERK1/2 pathway activation.

SIRT1;myocardil ishcmeic reperfusion injury; endoplasmic reticulum stress;apoptosis;ERK1/2 pathway

2014- 11- 27

2015- 04- 15

國家臨床重點?？芠財社(2011)170號];重慶市醫(yī)學(xué)重點學(xué)科[渝衛(wèi)科教(2007)2號]，重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研計劃重點項目(2012- 1- 022)

1001-6325(2015)06-0761-06

R541

A

*通信作者(corresponding author)：1594390020@qq.com