促紅細胞生成素抑制TGF-β誘導的大鼠心肌成纖維細胞增殖

王麗萍，王麗君，王小君

(河北聯合大學 基礎醫學院 1.生理學系; 2.唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室， 河北 唐山 063000)

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研究論文

促紅細胞生成素抑制TGF-β誘導的大鼠心肌成纖維細胞增殖

王麗萍1,2*，王麗君1,2，王小君1,2

(河北聯合大學 基礎醫學院 1.生理學系; 2.唐山市慢性病臨床基礎研究重點實驗室， 河北 唐山 063000)

目的探討促紅細胞生成素在大鼠心肌成纖維細胞(CFs)增殖中的作用。方法培養大鼠CFs。實驗分為對照組(control)、TGF-β刺激組(TGF-β終濃度為5 μg/L)和重組人促紅細胞生成素(rhEPO，5 000 U/L)干預組： 1 h后加入TGF-β。24 h后計數細胞并采用MTT法觀察細胞增殖；免疫細胞化學及Western blot法檢測α-SMA表達，觀察細胞轉化；羥脯氨酸定量檢測細胞膠原含量；Western blot法檢測細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及MMP- 2、MMP- 9表達。結果與對照組比較，TGF-β使細胞明顯增殖(P<0.05)，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成(P<0.05)、α-SMA表達(P<0.05)、細胞MMP- 2、MMP- 9表達增多(P<0.05)。使用重組人促紅細胞生成素(rhEPO)干預后，CFs增殖、α-SMA表達及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成較TGF-β組均顯著降低 (P<0.05)，MMP- 2、MMP- 9表達進一步增多(P<0.05)。結論生理劑量EPO可抑制TGF-β誘導的大鼠CFs增殖、轉化及膠原的合成，促進膠原降解。

促紅細胞生成素；心肌纖維化；心肌成纖維細胞

心肌纖維化(myocardial fibrosis, MF)是心血管疾病發生發展到一定階段的重要病理過程，是心室重塑持續發展和難于逆轉的主要原因，其發生機制至今仍未明確。心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖、表型轉化、分泌膠原增多及各型膠原比例失調是MF最主要的變化。但CFs增殖及遷移的原因及機制還不清楚。

促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)主要由腎臟皮、髓質交界處的管周細胞合成，屬造血生長因子家族。EPO通過與跨膜受體(erythropoietin-receptor，EPO-R)結合，調節紅系祖細胞的分化、凋亡，刺激幼稚紅細胞增生、分化和成熟。EPO還具有廣泛的非造血作用。大量研究表明，EPO可通過抗細胞凋亡、抗氧化應激、抗感染和促進血管新生等，對心血管發揮保護作用[1- 2]。對CFs的研究發現，EPO與依那普利合用可通過降低心肌氧化應激反應而抑制CFs的增殖和血管疾病的發生[3]。但EPO在心肌重構中的作用及機制還未見明確報道。本研究以CFs為研究對象，旨在探討EPO在心肌重構中的可能作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

SPF級雄性SD大鼠，體質量220～250 g，動物合格證號SCXK(京2009- 0008)(河北聯合大學實驗動物中心)。

重組人促紅細胞生成素(rhEPO)注射液(北京四環生物制藥股份有限公司)；轉化生長因子-β(TGF-β)和MTT試劑(Sigma公司)；免疫細胞化學試劑盒(碧云天生物試劑公司)；Western blot 相關試劑(Amresco公司)；兔抗α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、MMP- 2、MMP- 9多克隆抗體(Abcom公司)

1.2 CFs原代培養

常規原代培養大鼠CFs[4]，取第一代細胞用于實驗。

1.3 實驗分組

將細胞分成3組：1) 對照組； 2) TGF-β組：加入終濃度為5 μg/L的TGF-β；3)EPO組：終濃度為5 000 U/L EPO預孵育1 h后，加入終濃度為5 μg/L的TGF-β。

1.4 MTT法檢測CFs增殖

將對數增殖期CFs均勻接種于96孔培養板中，細胞2×104個/孔。常規培養24 h后，用含0.5%胎牛血清的DMEM繼續培養24 h后，進行分組加藥。24 h后每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，孵育4 h后吸掉孔內培養液，加入100 μL DMSO，振蕩，490 nm波長處測其吸光度A值。

1.5 免疫細胞化學法檢測CFs表型轉化

爬片細胞用4%多聚甲醛固定60 min后，加入1∶50的H2O2/甲醇，室溫孵育30 min，去除過氧化物酶； 0.5% Triton X-100室溫孵育30 min；5% 牛血清白蛋白室溫封閉60 min；滴加稀釋好的一抗(抗-α平滑肌肌動蛋白，1∶500)，4 ℃過夜。37 ℃復溫30 min，在細胞上滴加二抗(1∶150)，37 ℃孵育30 min； 中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.6 Western blot法檢測CFs中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及MMP- 2、MMP- 9的表達

取細胞培養上清液，10% 聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳分離蛋白，300 mA轉膜2 h將蛋白轉至硝酸纖維素膜。1% 牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h。滴加一抗(抗-Ⅰ型膠原、抗-Ⅲ型膠原、抗-基質金屬蛋白酶2、抗-基質金屬蛋白酶9)，4 ℃過夜；滴加二抗，室溫1 h；化學發光試劑放射自顯影。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 EPO對TGF-β介導的大鼠CFs增殖的影響

5 μg/L TGF-β作用24 h能明顯刺激CFs增殖(P<0.01)，EPO能明顯抑制TGF-β的促增殖作用(P<0.05)(圖1)。

2.2 EPO對TGF-β介導的大鼠CFs表型轉化的影響

在TGF-β刺激CFs增殖的過程中，myoFb標志物α-SMA表達增強，而EPO干預使其表達明顯回降(P<0.01)(圖2)。

2.3 EPO對TGF-β介導的大鼠CFs中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

TGF-β使CFs培養上清液中膠原含量及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達增強(P<0.01)，EPO的干預使CFs膠原合成明顯減少(P<0.05)(圖3)。

A.CFS proliferation by cell counting; B.CFS proliferation by MTT(n=6),*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with TGF-β group

圖1 EPO對TGF-β介導的大鼠CFs增殖的影響

Fig 1 Effects of EPO on CFs proliferation induced by TGF-β(n=5)

A.α-SMA expression in CFS by immunocytochemical staining (×400); B.α-SMA expression in CFS by Western blots;*P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with TGF-β group

圖2 EPO對TGF-β介導的大鼠CFs上α-SMA表達的影響

Fig 2 Effects of EPO on expression of α-SMA in CFs induced by TGF-β

2.4 EPO對TGF-β介導的大鼠CFs中MMP- 2、MMP- 9表達的影響

與對照組相比，TGF-β誘導CFs表達MMP- 2、MMP- 9增加(P<0.01)，EPO組MMP- 2、MMP- 9表達較TGF-β組進一步增多(P<0.01)(圖4)。

A.collagen expression in CFS by hydroxyproline kit; B.expression of Ⅰ,Ⅱ collagen in CFS by Western blot; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with TGF-β group圖3 EPO對TGF-β介導的大鼠CFs中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響Fig 3 Effects of EPO on expression of collagenⅠand Ⅲ in CFs induced by TGF-β(n=5)

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with TGF-β group圖4 EPO對TGF-β介導的大鼠CFs中MMP- 2、MMP- 9表達的影響Fig 4 Effects of EPO on expression of MMP- 2 and MMP- 9 in CFs induced by TGF-β(n=5)

3 討論

研究結果顯示，TGF-β導致大鼠CFs增殖、轉化及膠原合成， EPO可使這些變化減輕。提示EPO可能有抑制MF發生的作用。

已有大量研究證實EPO對心肌的保護作用。EPO 與EPOR 相互作用可通過MAPK、P13K-AKT以及JAK2-STATS蛋白等途徑，抑制心肌凋亡[5-9]。EPO參與心肌炎性反應。研究顯示， rhEPO可顯著減少中性粒細胞浸潤，減弱缺血再灌注誘導的核因子-κB(NF-κB)和活化蛋白-1(AP- 1)的活性，減少炎性因子產生，增加抗炎因子生成，降低心肌炎性反應[10]。EPO還可上調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平，促進梗死區周圍血管生成，減少梗死面積[11- 12]。

EPO在心肌重構中的作用受到廣泛重視。研究顯示，EPO-R在心肌血管內皮細胞、CFs和心肌細胞中均有表達。灌注EPO可使心肌中MAP激酶P42/P44磷酸化，使缺血再灌注后心肌細胞損傷減輕，最大程度恢復左室舒張壓和冠脈血流。在心肌梗死的C57BL/6小鼠，應用EPO干預治療顯著促進了左室的舒張過程，進而使左室射血分數維持穩定[9]。EPO還可抑制由Ang Ⅱ誘導的心肌成纖維細胞中TGF-β的生成及膠原的產生[13]。

本研究用TGF-β刺激大鼠CFs增殖后，發現生理劑量EPO可抑制TGF-β誘導的大鼠CFs增殖，減少myoFb標志物α-SMA的表達，說明其可能參與了抑制MF的過程。結果還顯示， TGF-β誘導大鼠CFs上Ⅰ、Ⅲ型膠原合成增多， EPO則使其表達下降；同時，EPO使TGF-β誘導的大鼠CFs上MMP- 2及MMP- 9表達進一步增加，表明EPO可抑制TGF-β誘導的膠原合成，促進膠原降解。進一步提示EPO在MF發生發展過程中可能具有重要作用，但其具體機制有待深入研究。

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Erythropoietin inhibits the proliferation of rat cardiac fibroblasts induced by TGF-β

WANG Li-ping1,2*, WANG Li-jun1,2, WANG Xiao-jun1,2

(1.Dept. of Physiology; 2.Tangshan Key Laboratory for Preclinical on Chronic Diseases,School of Basic Medicine, Hebei United University, Tangshan 063000, China)

Objective To explore the effect of erythropoietin on the proliferation of rat cardiac fibroblasts (CFs) induced by TGF-β. Methods Cultivated rats CFs were divided into three groups: control group, TGF-β group: the final concentration of TGF-β was 5 μg/L, recombinant human erythropoietin (rhEPO) treatment group: added TGF-β after incubation with 5 000 U/L rhEPO for one hour. After 24 hours, CFs proliferation was determined by MTT assay and cell counting; Immunocytochemistry and Western blot were conducted to observe α-SMA expression; The hydroxyproline concentration of CFs was assessed by hydroxyproline kit; CollagenⅠ，Ⅲ and MMP- 2，MMP- 9 synthesis of CFs were deteched by Western blot. Results Compared with control group, TGF-β promoted the CFs proliferation and transformation (P<0.05); TGF-β increased synthesis of collagenⅠ and collagen Ⅲ as well as MMP- 2 and MMP- 9 in CFs (P<0.05); After EPO intervention, CFs proliferation and transformation were decreased (P<0.05), collagenⅠand collagen Ⅲ synthesis were reduced (P<0.05), but the secretion of MMP- 2 and MMP- 9 increased (P<0.05). Conclusions Physiological dose EPO inhibits rat CFs proliferation, transformation and collagen production, in addition, EPO promote collagen degradation.

erythropoietin; myocardial fibrosis; cardiac fibroblasts

2014- 10- 20

2014- 12- 29

1001-6325(2015)06-0797-05

R542.2

A

*通信作者(corresponding author)：mywlpzjm@163.com