槲皮素通過Akt-mTOR途徑上調高糖培養RSC96細胞的自噬

屈 嶺，梁曉春，顧 蓓，張 宏，戴 威，石 玥

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 1.北京協和醫院 中醫科， 北京 100730；2.基礎醫學研究所 細胞中心， 北京 100005； 3.基礎醫學研究所 電鏡室， 北京 100005)

?

槲皮素通過Akt-mTOR途徑上調高糖培養RSC96細胞的自噬

屈 嶺1*，梁曉春1，顧 蓓2，張 宏2，戴 威3，石 玥1

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 1.北京協和醫院 中醫科， 北京 100730；2.基礎醫學研究所 細胞中心， 北京 100005； 3.基礎醫學研究所 電鏡室， 北京 100005)

目的探討槲皮素對高糖離體培養的RSC96細胞自噬變化規律的影響。方法RSC96細胞培養于含有槲皮素的高糖培養基中，超微結構應用透射電子顯微鏡觀察，用免疫熒光法、Western blot法檢測Beclin1、LC3Ⅱ、磷酸化的Akt及磷酸化的mTOR蛋白表達，用實時熒光定量PCR法檢測Beclin1 mRNA和LC3B mRNA的轉錄。結果高糖造成RSC96細胞Beclin1和LC3Ⅱ的表達下調，增加Akt和mTOR的磷酸化水平(P<0.05，P<0.01)，造成病理形態改變，減少自噬體數量。槲皮素能夠上調Beclin1和LC3Ⅱ的表達，下調Akt和mTOR的磷酸化水平(P<0.05，P<0.01)，修復病理損傷，增加自噬體數量。結論槲皮素通過下調Akt-mTOR途徑磷酸化水平而增加高糖培養RSC96細胞的自噬。

自噬；槲皮素；RSC96；高濃度葡萄糖

自噬是機體重要的生理過程。在機體受到損傷時，它可降解受損的細胞器，為細胞提供能量，維持細胞存活[1]。雷帕霉素受體(mTOR)、Ⅲ型磷酸磷脂酰肌醇激酶(ClassⅢ PI3K)等是自噬的主要調控因素[2]，其中mTOR為負調控作用[3- 4]，mTOR的活化與Akt/PKB活化密切相關[5- 6]。槲皮素廣泛存在于菟絲子、丹皮等多種中藥中，具有抗氧化、清除自由基等作用。其可增加被高糖抑制的神經細胞的增殖活性，減少氧化應激損傷，通過誘導自噬而減少凋亡[6- 8]。糖尿病周圍神經病變發病機制尚未闡明，自噬在延緩糖尿病慢性并發癥等方面具有重要的作用[1,4,9]，然而有關自噬與糖尿病周圍神經病變關系的研究較少。本研究通過離體實驗觀察槲皮素對高糖培養雪旺細胞中自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養基(Gibco公司)；槲皮素、丙酮酸鈉、3-MA和谷氨酰胺(Sigma公司)；胎牛血清、0.05%胰蛋白酶(Hyclone公司)；兔抗Beclin1多克隆抗體、兔抗LC3多克隆抗體、兔抗p-mTOR多克隆抗體和兔抗p-Akt多克隆抗體(Abcam公司)；TRITC標記的山羊抗兔IgG(北京西雅金橋生物技術有限公司)。

1.2 細胞培養和實驗分組

RSC96細胞(一種永生化的大鼠雪旺細胞，中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)。復蘇RSC96細胞，加入DMEM培養基、胎牛血清(10%)、丙酮酸鈉(終濃度1 mmol/L)、谷氨酰胺(終濃度4 mmol/L)、HEPES(終濃度12.5 mmol/L)，2～3 d換液1次。

實驗分組：1)正常對照(Con)組：DMEM培養基；2)高糖損傷(Glu)組：DMEM高糖培養基(葡萄糖終濃度125 mmol/L)；3)槲皮素治療(Que)組：DMEM高糖培養基+槲皮素終濃度25 μmol/L;4)甘露醇對照(Man)組：DMEM培養基(加入甘露醇使其與Glu組滲透壓一致)；5)雷帕酶素陽性對照(Rap)組：DMEM高糖培養基+雷帕酶素終濃度10 nmol/L；6)3-甲基腺嘌呤陰性對照(3MA)組：DMEM培養基+3-甲基腺嘌呤2 mmol/L。作用24 h。

1.3 Western blot檢測蛋白表達

各組細胞標本加入裂解液進行勻漿，離心取上清液，其蛋白濃度用BCA法測定，上清液用SDS-PAGE電泳分離，并轉移到硝酸纖維素膜上，用TBS-T中和硝酸纖維素膜降低非特異性結合。一抗孵育，沖洗后再用二抗孵育，采用ECL試劑盒檢測。條帶用Gel-Pro圖像分析系統進行分析，以目的蛋白/內參的吸光度比值的均數±標準差來表示。重復3次。

1.4 免疫熒光檢測蛋白表達及定位

制備細胞爬片，4 ℃丙酮固定，0.1% Triton-X 100打孔，加入正常血清封閉液。加入一抗工作液(1∶50稀釋，陰性對照組以PBS代替一抗)，濕盒中4 ℃過夜，加入二抗工作液(1∶100稀釋)，37 ℃孵育20 min，加入DAPI工作液，避光室溫下復染10 min。DAPI的藍色熒光，激發波長364 nm，發射波長488 nm；TRITC的紅色熒光，激發波長547 nm，發射波長620 nm。激光共聚焦顯微鏡下觀察并用Leica Confocal圖像分析軟件照相。采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量IA。每組選擇3個視野，重復3次。

1.5 實時定量PCR檢測mRNA

細胞總數大于106個/mL，按Trizol試劑盒說明抽提總RNA。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性，合成cDNA。根據NCBI GenBank 中提供的Beclin1和LC3B的mRNA序列，根據目的基因的RNA序列應用Primer Express2.0設計引物(表1)。按以下反應體系進行:2×SYBR Green qPCR mix 25 μL；上游引物F 1 μL，下游引物R 1 μL；cDNA template 2 μL。PCR擴增反應條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s(40個循環)。使用Sequence Detection Software 2.2對數據進行處理。計算出每份樣品中NGF進行PCR擴增時達到閾值時的Ct值，并通過內參校正。實驗中每份樣品均做3個復孔，重復3次。

表1 引物序列Table 1 The sequences of primers

1.6 RSC96細胞超微結構的觀察

2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，乙醇及純丙酮脫水，丙酮/環氧樹脂Epon812包埋，制成超薄切片，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛染色。各組在×3 000倍視野下，隨機選取10個視野。應用IPP6.0軟件計數自噬體數量、有核細胞數、含有自噬體的細胞數，計算有自噬體細胞數占有核細胞的百分比、每個細胞內平均自噬體數量等指標。重復2次。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1高糖毒性造成RSC96細胞中的自噬相關蛋白表達水平下調

作用24 h，Glu組LC3Ⅱ蛋白與LC3Ⅰ蛋白比值(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)均較Con組降低(P<0.05)(圖1A，B)。分別加入甘露醇、自噬促進劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤后，Glu組和3MA組Beclin1蛋白表達較Con組和Rap組減少(P<0.05，P<0.01)(圖1C，D)。

2.2槲皮素上調高糖培養RSC96細胞中的自噬相關蛋白表達

Que組Beclin1蛋白和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值表達較Glu組升高(P<0.05，圖2A～C)。RSC96細胞中細胞核被標記為藍色熒光，Beclin1和LC3蛋白被標記為紅色熒光(圖2D,E)。Glu組Beclin1蛋白的IA值較Con組明顯降低(P<0.01)；Que組IA值較Glu組明顯升高(P<0.01)，較Con組明顯降低(P<0.01)。Glu組LC3蛋白的IA值較Con組明顯降低(P<0.01)；Que組IA值較Glu組明顯升高(P<0.01)(圖2F，G)。

2.3槲皮素對高濃度葡萄糖培養RSC96細胞中自噬相關蛋白轉錄的影響

Glu組Beclin1和LC3 mRNA相對表達含量較Con組降低，Que組較Glu組升高，但各組間比較無統計學差異(圖3A，B)。

A, C.expression of Beclin1 and LC3 in different time were determined by Western blot; B, D.semiquantitative analysis; Con.control group; Glu.high glucose group; Man.mannitol group; Rap.rapamycin group; 3MA.3-methyladenine group; *P<0.05, **P<0.01 compared with Con group; #P<0.01 compared with Rap group

A.expression of Beclin1 and LC3 were determined by Western blot; B, C.semiquantitative analysis; D, E.Beclin1 and LC3 displaying red fluorescence visualized by confocal laser scanning microscope(×600); F, G.semiquantitative analysis; #P<0.05, ##P<0.01 compared with Glu group; *P<0.01 compared with Con group

2.4槲皮素增加高濃度葡萄糖培養RSC96細胞中的自噬

Con組RSC96細胞及細胞核呈卵圓形，核仁明顯，染色質均勻；細胞質內可見線粒體等細胞器，可見雙層膜結構的自噬體及自噬溶酶體(圖4A，B)。Glu組部分RSC96細胞的細胞核形態不規則，染色質不均，細胞質中自噬體及自噬溶酶體少見，直徑1 000 nm以上的空泡變性多見(圖4C，D)。Que組RSC96細胞及胞核多呈卵圓形，染色質尚均勻，自噬體較Glu組增多(圖4E，F)。

Glu組細胞中的自噬體數量、含有自噬體的細胞數、每個細胞內平均自噬體數量、含自噬體細胞占有核細胞百分比均較Con組和Que組減少(P<0.05，P<0.01)(圖4G，H)。

2.5 槲皮素增加Akt-mTOR途徑磷酸化水平

Glu組p-Akt表達較Con組升高(P<0.05)；Que組p-Akt表達較Glu組升高(P<0.05)。Glu組p-mTOR表達較Con組升高(P<0.05)；Que組表達較Glu組降低(P<0.05)(圖5A，B)。

A.the relative levels of Beclin1 mRNA; B.the relative levels of LC3 mRNA圖3 Beclin1和LC3 mRNA表達水平Fig 3 The relative levels of Beclin1 and LC3 mRNA transcripts

A, B.Con group; C, D.Glu group; E, F.Que group; G,H.semiquantitative analysis of autophagosome number; nucleus(N), mitochondria (▲), autophagosome (△), vacuole structures(V); *P<0.05, **P<0.01 compared with Glu group

A.expression of p-Akt and p-mTOR were determined by Western blot; B.semiquantitative analysis; *P<0.05 compared with Glu group

3 討論

LC3是自噬體的標志分子，其含量的多少與自噬泡數量的多少成正比[10]。Beclin1基因表達與自噬的發生正相關，可對細胞自噬活性進行動態監測和判斷[11]。本研究發現高濃度葡萄糖可造成RSC96細胞中LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值和Beclin1蛋白表達的下調，而甘露醇組則沒有上述改變，提示下調自噬的作用與高糖毒性有關，而與滲透壓無關。槲皮素則可以上調LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ的比值和Beclin1蛋白的表達，且LC3和Beclin1 mRNA的轉錄水平與蛋白表達趨勢一致，表明槲皮素可上調高糖環境中雪旺細胞自噬相關蛋白的表達。

經檢索未見到有關高糖環境對體外培養雪旺細胞超微結構影響的文獻報道。以其他細胞為模型的離體實驗中發現高糖可造成細胞腫脹、細胞器減少及空泡變性等病理損傷[12- 14]。高糖對細胞超微結構的損傷可能與細胞代謝障礙有關[15]。細胞受到外界損傷因素作用時，可通過自噬途徑降解自身受損的細胞器以維持合成代謝與能量供給。本研究通過透射電鏡觀察到正常條件下RSC96細胞中自噬體多呈直徑300～900 nm(平均500 nm左右)的雙層膜結構，與前人文獻報道一致[10- 11]。高糖則可造成RSC96細胞形態不規則，線粒體等細胞器腫脹變形。細胞質中1 000 nm以上的空泡變性多見，且這些空泡沒有雙層膜樣結構。自噬體及自噬溶酶體數量明顯減少。槲皮素治療后RSC96細胞形態較高糖組改善，自噬體數量增多。

自噬的發生受到mTOR途徑的負調控。其中Akt/PKB活化后可抑制其下游的TSC1/2，促進mTOR的激酶活性，增加P70S6及4EBPs的活化，減少自噬形成[2- 6]。本實驗進一步研究發現高糖可上調Akt和mTOR磷酸化的水平，而槲皮素則能抑制Akt和mTOR的激活。推測槲皮素上調高糖培養雪旺細胞自噬的作用可能與抑制Akt-mTOR的活化有關。

綜合上述分子生物學及超微結構檢測結果，推測槲皮素可增加高糖培養雪旺細胞的自噬，該作用可能與Akt-mTOR途徑有關。但是現有研究尚未完全揭示自噬在高糖毒性中具體的作用機制。在今后的工作中可進一步通過在體研究印證自噬對糖尿病周圍神經病變的影響及槲皮素的保護機制，為研發防治糖尿病周圍神經病變的藥物奠定基礎。

[1] Gonzalez CD, Lee MS, Marchetti P,etal. The emerging role of autophagy in the pathophysiology of diabetes mellitus[J]. Autophagy，2011，7：2- 11.

[2] Lee J, Giordano S, Zhang J. Autophagy, mitochondria and oxidative stress: cross-talk and redox signalling[J]. Biochem J，2012，441：523- 540.

[3] Wang Q, Liang B, Shirwany NA,etal. 2-deoxy-D-glucose treatment of endothelial cells induces autophagy by reactive oxygen species-mediated activation of the AMP-activated protein kinase[J]. PLoS One，2011，6：e17234. doi: 10.1371/journal.pone.0017234.

[4] Xie Z, Lau K, Eby B,etal. Improvement of cardiac functions by chronic metformin treatment is associated with enhanced cardiac autophagy in diabetic OVE26 mice[J]. Diabetes，2011，60：1770- 1778.

[5] Hu P, Lai D, Lu P,etal. ERK and Akt signaling pathways are involved in advanced glycation end product-induced autophagy in rat vascular smooth muscle cells[J]. Int J Mol Med，2012，29：613- 618.

[6] Wang K, Liu R, Li J,etal. Quercetin induces protective autophagy in gastric cancer cells: involvement of Akt-mTOR-and hypoxia-induced factor 1α-mediated signaling[J]. Autophagy，2011，7：966- 978.

[7] Shi Y, Liang XC, Zhang H,etal. Quercetin protects rat dorsal root ganglion neurons against high glucose-induced injuryinvitrothrough Nrf- 2/HO- 1 activation and NF-κB inhibition[J]. Acta Pharmacol Sin，2013，34：1140- 1148.

[8] Harris CS, Asim M, Saleem A,etal. Characterizing the cytoprotective activity of Sarracenia purpurea L, a medicinal plant that inhibits glucotoxicity in PC12 cells[J]. BMC Complement Altern Med，2012，12：245. doi: 10.1186/1472- 6882- 12- 245.

[9] Miranda S, González-Rodríguez A, García-Ramírez M,etal. Beneficial effects of fenofibrate in retinal pigment epithelium by the modulation of stress and survival signaling under diabetic conditions[J]. J Cell Physiol，2012，227：2352- 2362.

[10] Klionsky DJ, Abdalla FC, Abeliovich H,etal. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy[J]. Autophagy，2012，8：445- 544.

[11] Wu CY, Tang ZH, Jiang L,etal. CSK9 siRNA inhibits HUVEC apoptosis induced by ox-LDL via Bcl/Bax-caspase9-caspase3 pathway[J]. Mol Cell Biochem，2012，359:347- 358.

[12] Shen XP, Shu CD, He J. Effect of high glucose or high glucose and high insulin level on phagocytotic function and ultrastructure of activated rat alveolar macrophages[J]. Chin J Pathophysiol，2000，16：357- 361.

[13] Zhu Q, Zhu SR, Kan FY. Effect of high glucose concentration on cultured rabbit Lens’ epithelial cells[J]. J Tongji Univ (Med Sci)，2002，14：14- 17.

[14] Xiao XC, Zhou QL, Wu XY,etal. Effect of PPARγ agonists on the morphologic change and the expressions of FSP1 and E2cad in human renal tubule cells cultured in high glucose medium[J].J Clin Res， 2008，25：2220- 2225.

[15] Ishibashi Y, Sugimoto T, Ichikawa Y,etal. Glucose dialysate induces mitochondrial DNA damage in peritoneal mesothelial cells[J]. Perit Dial Int，2002，22：11- 21.

新聞點擊

含糖飲料傷害腦功能導致行為異常

據英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013-11-18報道，澳大利亞最近一項研究發現，經常攝入含糖碳酸飲料會導致“多動癥”，長期飲用這類飲料還會導致大腦數百種蛋白質的改變，這種變化模式類似于老年癡呆癥發生時的變化。

悉尼麥考瑞大學(Macquarie University in Sydney)的研究人員Jane Franklin女士表示，“我們的研究顯示，長期食用這些含糖飲料來代替水，可能引起持久的行為變化和明顯的大腦蛋白質化學成分的改變。”

含糖軟飲料對身體的損害涉及到各個系統，會導致心臟病、糖尿病、超重、骨質變脆、胰腺癌、前列腺癌、肌肉無力和麻痹等諸多潛在的問題。這項新研究則著重于含糖軟飲料對大腦的損傷及行為、意識方面的改變。

Franklin的研究小組比較了喝普通水及喝含糖水兩組大鼠的情況。實驗所用的含糖水中的糖含量與我們日常所飲用的含糖軟飲料所含的糖量相當。僅僅1個月后，吃含糖水的大鼠變得過動、不安。取一部分這組大鼠的大腦組織檢查發現，有近300種不同的蛋白質成分發生了變化。

Quercetin up-regulates autophagy in RSC96 cells cultured in high glucose via the pathway of Akt-mTOR

QU Ling1*, LIANG Xiao-chun1, GU Bei2, ZHANG Hong2, DAI Wei3, SHI Yue1

(1.Dept. of Traditional Chinese Medicine，PUMC Hospital，PUMC & CAMS，Beijing 100730; 2.Cell Center，Institute of Basic Medical Sciences，
PUMC & CAMS，Beijing 100005; 3.Dept. of Electron Microscope, Institute of Basic Medical Sciences, PUMC & CAMS，Beijing 100005，China)

ObjectiveTo observe the effect of the quercetin on autophagy of RSC96 cultured in high glucose.MethodsRSC96 cells were cultured with high glucose or quercetin.Ultrastructure was performed using transmission electron microscopy. The expression of beclin1, LC3Ⅱ, phosphorylation of Akt (p-Akt), and phosphorylation of mTOR (p-mTOR) were detected by immunofluorescence and Western blot.Real-time fluorescent PCR analysis showed that the level of Beclin1 mRNA and LC3 mRNA.ResultsQuercetin significantly alleviated the pathological morphology of RSC96 cells and up-regulated the Beclin1 and LC3-Ⅱexpressions(P<0.05，P<0.01), increased autophagosome, but down-regulated the p-Akt and p-mTOR expressions(P<0.05，P<0.01).ConclusionsQuercetin up-regulates autophagy in RSC96 cells cultured in high glucose by the pathway of Akt-mTOR.

autophagy; quercetin; RSC96; high glucose

2015- 01- 28

：2015- 03- 13

國家自然科學基金(81403224)；北京市自然科學基金(7132189)；北京協和醫院科研基金(2013-098)

*通信作者(correspondingauthor)：quling@pumch.cn

1001-6325(2015)05-0596-07

研究論文

R587. 2

：A