榨菜葉中RNA提取及硫苷酶基因序列測(cè)定與分析

張燕，侯坤蘭

（1.長(zhǎng)江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶，408100；2.重慶長(zhǎng)江師范學(xué)院）

榨菜葉中RNA提取及硫苷酶基因序列測(cè)定與分析

張燕，侯坤蘭

（1.長(zhǎng)江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶，408100；2.重慶長(zhǎng)江師范學(xué)院）

采用Trizol試劑法從榨菜葉中提取RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到硫苷酶基因保守序列，利用DNAman7生物信息分析軟件對(duì)測(cè)得的保守序列與菜心硫苷酶基因保守序列進(jìn)行比對(duì)，翻譯核苷酸和蛋白質(zhì)序列與蕓薹屬油菜、菜心、甘藍(lán)、芥菜等序列進(jìn)行相應(yīng)的比對(duì)。結(jié)果表明，采用Trizol試劑法能獲得320 bp的基因保守序列；與甘藍(lán)、菜心硫苷酶基因保守序列比對(duì)結(jié)果的Identity為97.12%；與蕓薹屬油菜、菜心、甘藍(lán)等進(jìn)行相應(yīng)的翻譯核苷酸和翻譯成蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)序列的覆蓋度與相似度均達(dá)到較高的水平。

榨菜；硫苷酶基因；保守序列

硫苷酶即硫代葡萄糖苷酶，主要存在于十字花科植物中，能催化硫代葡萄糖苷即硫苷，水解產(chǎn)生異硫代氰酸鹽、葡萄糖、硫代氰酸鹽等物質(zhì)，有較好的防癌和抗菌功效[1，2]。同時(shí)，硫苷—硫苷酶系統(tǒng)作為植物本身來(lái)說(shuō)是一個(gè)很好的自我防備體[3]，此體系在探究防御病蟲(chóng)害方面目前已進(jìn)入熱潮。研究發(fā)現(xiàn)，硫苷酶是一類非組織型表達(dá)蛋白，通常在植物體內(nèi)含量較少，因此，從植物獲取較多的硫苷酶很難實(shí)現(xiàn)[4，5]。重慶涪陵盛產(chǎn)榨菜，利用此優(yōu)勢(shì)，對(duì)榨菜硫苷酶基因進(jìn)行研究，加大對(duì)榨菜葉的充分利用，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)榨菜產(chǎn)品的創(chuàng)新過(guò)程提供一定依據(jù)，具有廣大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。

目前對(duì)于硫苷酶基因的研究大多是以油菜、蘿卜、芥藍(lán)、大白菜等十字花科植物為材料[6~9]，而對(duì)榨菜中硫苷酶基因的研究卻十分匱乏[10]。根據(jù)前人對(duì)植物組織中總RNA提取方面研究可知主要存在以下幾個(gè)方面的原因：首先是植物材料的影響；其次是植物組織里的多酚、多糖或次級(jí)代謝產(chǎn)物等也會(huì)對(duì)RNA提取產(chǎn)生一定的影響；再次是RNA酶對(duì)RNA的降解作用[11，12]。國(guó)內(nèi)在研究獲得不同的硫苷酶基因時(shí)采用多種不同方法進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[13]。迄今為止，從白芥芥子酶基因cDNA的分離的第1編碼基因[14]，國(guó)內(nèi)外的研究者陸續(xù)從甘藍(lán)、油菜、蘿卜、西蘭花[15]等十字花科植物中提取出了硫苷酶基因并將其基因進(jìn)行克隆和原核表達(dá)。比如，2007年謝麗雪從幼嫩的芥藍(lán)葉片中分離克隆出硫苷酶基因并進(jìn)行序列分析；2009年梁錦峰從西蘭花幼葉中分離克隆出硫苷酶基因并進(jìn)行序列分析。

根據(jù)多次實(shí)踐比較，采用最佳的Trizol試劑法從榨菜葉中提取RNA和設(shè)計(jì)相應(yīng)的RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物而得到榨菜硫苷酶基因的保守序列[16]。分析榨菜硫苷酶基因在十字花科植物蕓薹屬中的油菜、甘藍(lán)、菜心等序列的相似程度。榨菜硫苷酶基因的研究為榨菜葉中硫苷酶基因的原核表達(dá)及cDNA全長(zhǎng)序列的獲得奠定基礎(chǔ)，對(duì)榨菜葉以及榨菜中硫苷酶得以充分利用，提高榨菜硫苷酶含量、活性等有重要意義，可為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)榨菜產(chǎn)品的創(chuàng)新提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)內(nèi)容

采用Trizol試劑法從榨菜葉中提取RNA，通過(guò)在線設(shè)計(jì)程序NCBI的Primer Blast以及http:// www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer等得到所需的上、下游引物[17]。由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行引物合成。榨菜中硫苷酶基因保守序列的獲得，首先以植物總RNA為模板合成第1鏈cDNA，接著再以第1鏈cDNA為模板對(duì)硫苷酶基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，再通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增結(jié)果并進(jìn)行序列測(cè)定，最后結(jié)合DNAman7、NCBI等進(jìn)行序列分析。

1.2 試驗(yàn)材料

①植物材料榨菜Brassica juncea(L.)Czern. et Coss.var.tumidaTsen et Lee，試驗(yàn)采用永安小葉（地方發(fā)掘品種），購(gòu)于重慶涪陵綠源農(nóng)業(yè)科技發(fā)展公司。

②主要試劑液氮、Trizol試劑、異丙醇、氯仿、0.1%的DEPC水溶液、蒸餾水、超純水、5 mol/L NaCl溶液、75%乙醇溶液、Oligo dT（0.5 μg/μL）、RNase free H2O、5×Reacetion Buffer、RNase Inhibitor（20 U/μL）、DNTP Mix（10 mmol/L）、AMV RT（10 U/L）、液體石蠟、瓊脂糖粉、1×TAE溶液、GoldviewTM核酸染料、10× PCR Buffer、DNTP Mixture Solution、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶、DNA Marker 2 000、6×Glycerol DNA loading Buffer、0.5×TBE溶液等。

③主要儀器離心管（15 mL、1.5 mL）、制冰機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫干燥器、電泳儀、PCR儀、低溫冰箱（4℃、-20℃）、超低溫冰箱（-72℃）、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3 榨菜葉中提取總RNA和電泳檢測(cè)

選取榨菜種子數(shù)粒在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，待到榨菜幼苗長(zhǎng)到2葉期，即可用于RNA提取。榨菜葉中總RNA的提取采用的是根據(jù)實(shí)際情況改良后的Trizol試劑一步分離總RNA法，反復(fù)多次提取。

方法如下：稱量0.5g新鮮榨菜葉片在液氮中快速研磨至粉末，放入盛有5mL Trizol試劑的RNase-free離心管中（置于冰上），充分混勻；將混勻的組織室溫放置約10 min，使其中核酸蛋白復(fù)合體物完全分離（此過(guò)程可適當(dāng)延長(zhǎng)）；將混合物4℃，7200r/min離心20min，并取上清到新的離心管2號(hào)中；再向離心管2號(hào)加1 mL氯仿，5 mol/L NaCl溶液1mL，劇烈振蕩15 s，室溫放置2 min（或直接離心）；將離心管2號(hào)在4℃，離心20min，7500r/min，樣品會(huì)分3層（RNA存在于上層水樣），取上層無(wú)色水樣到離心管3號(hào)里（不要吸取中間界面）；向離心管3號(hào)中加異丙醇2.5 mL并充分混勻，放在室溫10min，再進(jìn)行4℃，離心20 min，7 200 r/min，去上清液，管底部管壁有膠狀沉淀即為RNA；加75%乙醇4mL，并在4℃離心5min，7200r/min條件下洗滌沉淀，去上清液后再重復(fù)1次；吹干（或空氣干燥）約10min；加0.5mL 0.1%DEPC水溶液（經(jīng)高溫高壓滅菌后的），（若發(fā)現(xiàn)沉淀難溶時(shí)）用65℃溶解10min，-72℃保存。

電泳檢測(cè)時(shí)用移液槍取2μL RNA溶解液與1 μL loading Buffer在PCR管中混勻；后用移液槍吸取混合物上樣于1%瓊脂糖凝膠中，調(diào)整電壓100 V、電流50 mA，進(jìn)行電泳30 min；在紫外光下觀測(cè)到28S RNA∶18S RNA大約為2∶1，且條帶清晰、明亮則可用于后續(xù)的試驗(yàn)。

1.4 第1鏈cDNA鏈合成

在冰浴的1.5mL離心管里依次加入總RNA3μL、Oligo dT（0.5 μg/μL）1 μL，再加RNase-free H2O定容至10 μL。后將上述反應(yīng)混合物混勻，2 000 r/min下離心10 s，反應(yīng)混合物在65℃水浴鍋中溫育5 min后，冰浴30 s，接著2 000轉(zhuǎn)/min離心5 s后將離心管放于冰盒上。第1鏈cDNA合成反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

接著將上述反應(yīng)混合物混勻后，2 000 r/min離心5 s。然后將上述反應(yīng)混合物全部轉(zhuǎn)移至PCR管中，并向PCR管中加入25 μL液體石蠟，再將其置于PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)程序見(jiàn)表2，完成上述反應(yīng)后，將PCR管置于冰盒上。

1.5 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank上已經(jīng)有的植物硫苷酶基因序列和相關(guān)參考文獻(xiàn)，再根據(jù)引物設(shè)計(jì)的一般規(guī)則分別設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，用http://seq.yeastgenome.org/ cgi-bin/web-primer在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，然后用DNAman7進(jìn)行引物評(píng)估，設(shè)計(jì)好的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。設(shè)計(jì)的引物如下：上游引物MS-up:5'-CCTCAAACACTCCAAGATG-3'；下游引物MS-down:5'-CTTGTAATCATCACAGGTCCA-3'。

1.6 RT-PCR擴(kuò)增得到硫苷酶基因保守區(qū)域

先做4個(gè)平行反應(yīng)準(zhǔn)備，向冰上的每個(gè)離心管中逐次加入試劑，從-20℃冰箱中取出酶立即置于冰上，吸取所需量加入PCE管后再立即放回-20℃冰箱中，根據(jù)PCR反應(yīng)體系再加入相應(yīng)的試劑。

表1 第1鏈cDNA合成的反應(yīng)體系

表2 第1鏈cDNA合成的PCR反應(yīng)程序

其次，在離心管中分別加入2 μL模板DNA，并加入DEPC處理水使終體積均為50 μL，在各管中加入適量滅菌石蠟油，2 000 r/min離心60 s，再將溶液分別轉(zhuǎn)移至PCR管中。PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表3，RT-PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表4。

1.7 序列測(cè)定與分析

此次試驗(yàn)測(cè)得的是榨菜中硫苷酶基因的保守序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。該保守序列主要通過(guò)NCBI及DNAman7進(jìn)行分析。

表3 RT-PCR反應(yīng)體系

表4 RT-PCR反應(yīng)程序

2 結(jié)果與分析

2.1 榨菜葉總RNA提取

由圖1可知，榨菜總RNA樣品電泳結(jié)果在紫外光下觀察到28S RNA、18S RNA、5S RNA三個(gè)特征性條帶，且條帶間沒(méi)有明顯的彌散現(xiàn)象。28S RNA和18S RNA兩條帶比較明亮、清晰，亮度高于低分子量的5S RNA。其中28S RNA∶18S RNA亮度比約為1.5∶1而沒(méi)有完全達(dá)到2∶1。

圖1 總RNA電泳

圖2 RT-PCR產(chǎn)物的電泳

經(jīng)分析，這可能是在RNA提取過(guò)程中更換手套不及時(shí)導(dǎo)致接觸到可能污染了RNA酶的物品[11]，另外也可能由于在電泳過(guò)程中將冷凍的RNA解凍后沒(méi)能及時(shí)點(diǎn)樣，受到溫度和空氣中的RNase的影響；同時(shí)電泳時(shí)因電泳槽未能清洗干凈而使得TAE緩沖液有所污染，最終使得RNA有輕微降解，但從電泳圖也可得出RNA質(zhì)量還是較高的，沒(méi)有明顯降解，可用于合成第1鏈cDNA[11]。因?yàn)閏DNA的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于RNA，易于保存。

2.2 硫苷酶基因保守序列的RT-PCR擴(kuò)增與分析

由圖2可知，提取的RNA樣品的第1鏈cDNA合成后，通過(guò)用硫苷酶基因保守序列的一對(duì)上、下游引物進(jìn)行RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增榨菜中硫苷酶的cDNA片段，再通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。電泳結(jié)果表明，泳道1、2、4均擴(kuò)增失敗而沒(méi)有目的條帶，只有泳道3中的條帶較清晰、明亮，無(wú)明顯拖帶現(xiàn)象，通過(guò)電泳圖中DNA Marker 2 000可以看出，擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基數(shù)在200～500 bp，與預(yù)計(jì)的目的片段大小相似，可用作保守序列測(cè)定。但泳道1、2、4均不能作序列測(cè)定。經(jīng)分析，泳道1可能是DNA模板的量偏多，泳道2和4可能是因?yàn)镻CR反應(yīng)體系中鎂離子的量不夠或者DNA模板量偏少所致。

2.3 硫苷酶基因保守序列的分析

硫苷酶基因序列測(cè)定由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的硫苷酶基因保守序列如下：320 bp（不含上、下游引物）。

①保守序列片段的比較分析由圖3可知，將測(cè)得的榨菜硫苷酶基因保守序列與已有的硫苷酶基因保守序列（如甘藍(lán)M YB.olerac ea-M登錄號(hào)：AY957579以及菜心M Y 49B.parachinensis-M登錄號(hào)：AY957578）[3]在DNAman7軟件中進(jìn)行序列比對(duì)。可看出榨菜硫苷酶基因保守序列堿基有缺失、多余和錯(cuò)誤，如榨菜相對(duì)于菜心和甘藍(lán)都缺失了“CCGCCA”、“CA”、“AAGCAC”、“T”，都多余了“T”、“GGG”。其中不同的堿基是第36 bp：菜心和榨菜都為“G”，甘藍(lán)為“A”；第64 bp：甘藍(lán)與菜心為“T”，榨菜為“A”；第143 bp:榨菜和甘藍(lán)都為“G”，菜心為“A”；第146 bp:榨菜和菜心都為“G”，甘藍(lán)為“A”；第317 bp、318 bp:甘藍(lán)和菜心都為“AG”，榨菜為“GT”。三種植物硫苷酶基因序列比對(duì)中，堿基有所差異，但總體比對(duì)的Identity為97.12%。由結(jié)果得出同是蕓薹屬的榨菜與已有的菜心、甘藍(lán)硫苷酶基因的一致性較高。與此同時(shí)，將測(cè)得的榨菜硫苷酶基因序列在NCBI中進(jìn)行nucleotide blast。由圖4可知，該基因與甘藍(lán)（登錄號(hào)：AY957579.1）、菜心(登錄號(hào)：AY957578.1)、油菜（登錄號(hào)：EF583560.1）的硫苷酶的核苷酸的Query cover均為97%和I-dentity分別為97%、96%、96%。

圖3 榨菜硫苷酶基因保守序列與甘藍(lán)、菜心硫苷酶基因保守序列的對(duì)比分析

注：下圖為測(cè)得的硫苷酶基因保守序列（320 bp）

②保守序列的翻譯核苷酸序列分析根據(jù)常用的生物信息檢索分析網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，將測(cè)得的榨菜硫苷酶基因保守序列與NCBI中已有的蕓薹屬的翻譯核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明與油菜硫苷酶基因mRNA，部分cd（登錄號(hào)：EU 192929.1）、菜心硫苷酶基因mRNA（登錄號(hào)：XM009124972.1）、甘藍(lán)硫苷酶基因mRNA，完整的cd（登錄號(hào)：EU 004075）以及油菜硫苷酶完整外顯子（登錄號(hào)：L11258.1）的覆蓋度（Query cover）和E value分別為：97%、96%、96%、93%和2e-28、2e-27、2e-27、6e-24。由此可知，測(cè)得的硫苷酶基因保守序列可作為模板，得到相應(yīng)的編碼序列，編碼相應(yīng)的硫苷酶。總的來(lái)說(shuō)，參與比對(duì)的榨菜硫苷酶基因序列大多數(shù)堿基參與了比對(duì)，但仍有少部分沒(méi)能比對(duì)得出，有缺失、錯(cuò)誤及插入。同時(shí)結(jié)合E value的值都小于10-5，可知比對(duì)序列之間的相似性較高。

③保守序列片段翻譯成蛋白質(zhì)序列分析根據(jù)常用的生物信息檢索分析網(wǎng)站http://www.ncbi. nlm.nih.gov/，將測(cè)得的榨菜硫苷酶基因保守序列翻譯成蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，因此將測(cè)得的序列在NCBI中的進(jìn)行blastx，結(jié)果表明與菜心（登錄號(hào)：AAX68548.1）、甘藍(lán)（登錄號(hào)：ABS30827.1）和歐洲油菜（登錄號(hào)：ABW70826.1）的序列的覆蓋度和同源性分別為：97%、98%、98%和98%、97%、94%，由此可得出，榨菜與同為蕓薹屬的菜心、甘藍(lán)和油菜硫苷酶基因保守序列翻譯成的蛋白質(zhì)序列的相似性較高。

3 討論與結(jié)論

硫苷酶基因作為編碼硫苷酶的基因，包含完整的編碼硫苷酶蛋白中氨基酸的編碼序列，而硫苷酶在榨菜中含量特別少。本試驗(yàn)通過(guò)提取榨菜葉總RNA，進(jìn)而運(yùn)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到硫苷酶基因的保守序列，為進(jìn)一步運(yùn)用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到硫苷酶基因的全長(zhǎng)序列以及如何提高榨菜中硫苷酶的生理作用及特性奠定基礎(chǔ)。而且，在國(guó)內(nèi)外有關(guān)硫苷酶基因的研究中，未曾有相關(guān)學(xué)者以榨菜為試驗(yàn)材料獲得硫苷酶基因。

另外，本試驗(yàn)只選擇了一種提取總RNA的方法即Trizol試劑一步分離總RNA法從榨菜葉中提取RNA。因此，難免總RNA質(zhì)量和濃度有偏差。電泳檢測(cè)得到的條帶雖然是很清晰、明亮，但是在28S RNA和18S RNA的亮度比沒(méi)有完全達(dá)到2∶1，而是稍微接近比值，但對(duì)于進(jìn)一步合成第1鏈cDNA沒(méi)有太大的影響。

對(duì)于通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到產(chǎn)物的電泳檢測(cè)，從目的條帶的大小可見(jiàn)，可以用于序列測(cè)定。因此，在將測(cè)得序列在NCBI及軟件DNAman7中進(jìn)行序列比對(duì)與分析中，得到的覆蓋度、相似度等達(dá)到較高水平，因此也初步證明了測(cè)得的基因序列為硫苷酶基因[6]。總的來(lái)說(shuō)，對(duì)榨菜硫苷酶基因的研究為榨菜葉中硫苷酶基因的原核表達(dá)及cDNA全長(zhǎng)序列的獲得奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)榨菜中硫苷酶得以充分利用，提高榨菜硫苷酶含量、活性，以及加大對(duì)榨菜葉的充分利用等有重要意義，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)榨菜產(chǎn)品的創(chuàng)新提供一定依據(jù)。

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Extracting RNA from Leaves of MustardBrassica Junceaand Measurement and Analysis of Myrosinase Gene

ZHANG Yan,HOU Kunlan
(Life Science and Technology College,Yangtze Normal University,Chongqing 408100)

This purposes of this research is to lay the foundation for prokaryotic expression and to improve the content and activity of myrosinase in mustardbrassica junceaat the same time.The research material was taken from myrosinase gene in mustardbrassica juncea.This topic get conserved sequence of myrosinase gene taken from leaves for the method used, for extraction of RNA from mustardbrassica juncealeavesthat Trizol reagent step separation method of total RNA, according to the conserved nucleotide sequences of different plants and conservative sequence obtained by RT-PCR, conserved sequence alignment between the obtained andBrassica rapeon the DNAman7 bioinformatics analysis software, myrosinase translated nucleotides sequence and protein sequence alignment analysis online combined the NCBI and main withBrassica napue,Brassica rape,Brassica oleracea,Brassica Juncea,etc.The results shows that under identical conditions:320bp gene conserved sequence was obtained by method of Trizol reagent step separation,bioinformatics analysis suggested that conserved sequence showed 97.12%identity to M YB.oleracea-M,M Y 49B.parachinensis-M, myrosinase translated nucleotides sequence and protein sequence of Mustardbrassica junceahas a higher query cover and identity withBrassica napue,Brassica rape,Brassica oleracea,etc.It found that the similarity of sequence coverage have reached a higher level.

Mustard brassica juncea;Myrosinase gene;Conserved sequence

S637.3

A

1001-3547（2015）20-0065-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.20.026

重慶市應(yīng)用開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目B類（cstc2013yykfA10003）：從榨菜葉中提取異硫代氰酸鹽的技術(shù)研究與應(yīng)用

張燕（1977-），女，講師，碩士，主要從事細(xì)胞與分子生物學(xué)研究，E-mail：28789155@qq.com

2015-09-01