低溫幾丁質酶chiA基因克隆、同源建模及序列分析

王曉輝，曹洪玉，張慶芳，遲乃玉

（大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622）

低溫幾丁質酶chiA基因克隆、同源建模及序列分析

王曉輝，曹洪玉，張慶芳，遲乃玉

（大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622）

從假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp. DL-6）中克隆低溫幾丁質酶chiA基因（GenBank登錄號KF234015）。該序列全長3160個核苷酸，編碼1053個氨基酸，預測相對分子質量113.5 KDa，等電點（pI）4.49，命名為chiA。功能結構域分析顯示其編碼區包含信號肽、2個幾丁質結合域、2個成人多囊腎病結構域、18家族幾丁質酶催化域與18家族糖苷水解酶C端部分序列。利用Discovery Studio平臺以同源建模的方法構建低溫幾丁質酶chiA的催化域三維結構模型，并對其進行結構優化和評估，Ramachandram圖譜檢測和Verify-3D評估顯示模擬出的模型結構合理，整體的相容性較為可信。本結果擬為后期低溫幾丁質酶chiA的催化機理研究提供理論依據。

低溫幾丁質酶chiA；假交替單胞菌；同源模建；序列分析

幾丁質是海洋環境含量最豐富的可再生資源，據估測，海洋環境每年超過1011噸幾丁質形成，其降解主要是通過產幾丁質酶的微生物完成[1]。酶法降解主要通過內切酶隨機切割多糖鏈，外切酶沿糖鏈末端降解，整個水解過程是通過糖苷水解酶系來完成的[2]。酶法高效降解具有反應條件溫和，無污染，降解過程易控制等優點，是國內外利用可再生資源的發展方向[3]。幾丁質酶(chitinase, chi, EC3.2.1.14)降解幾丁質生產的幾丁寡糖、幾丁單糖及其衍生物由于具有良好的組織兼容性和生物降解性以及調節免疫力和抗癌的保健功能等特點，在醫藥、食品、農業、工業等領域有著廣泛的應用前景[4,5]。

近年來，隨著基因工程技術的不斷發展，低溫幾丁質酶的研究重點逐步轉向酶基因的克隆表達及功能研究。截至目前，僅有10多種低溫幾丁質酶基因被克隆、測序及性質表征，僅解析1種低溫幾丁質酶的結晶結構，以及1種低溫幾丁質酶的催化域[6]，分別為來源于菌株Moritella marina的MmChi60和南極菌Arthrobacter sp. TAD20幾丁質酶chiB的催化域。低溫幾丁質酶的結構解析對于深入探討低溫酶的反應機制、底物結合和催化效率等有重要意義。蛋白結構測定主要是依靠NMR技術和X射線晶體衍射，但方法復雜、價格昂貴，無法大規模測定蛋白質信息，故以計算機技術為基礎的同源建模在蛋白質結構的研究中發揮重要作用。同源建模[7]是從蛋白的氨基酸序列出發，即在序列一致性大于30%的前提下，可以利用一個或多個相似蛋白的結構信息來模擬建立未知結構蛋白質的三維結構。因此，相似蛋白之間一級序列的一致性越高，模建出來的三維結構的準確性越高。利用同源建模技術模擬蛋白質的三維結構，深入探討結構信息進而可深入了解蛋白質的功能。

假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)是海洋環境產幾丁質酶系的代表性微生物，Tsujibo等[8-10]報道該屬分泌幾丁質降解系統至少包括 4種幾丁質酶，3種N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，1種糖基轉移酶，1種幾丁質結合蛋白和1種蛋白酶，協同降解幾丁質，應用潛力巨大。但國外已報道的野生菌生產幾丁質酶活力較低，國內未見該菌屬生產幾丁質酶功能研究的相關報道。本文從海洋底泥樣品中篩選到高產幾丁質酶的交替假單胞菌，命名為 Pseudoalteromonas sp. DL-6(Genebank登錄號KF208362)，從該菌株克隆了低溫chiA基因，對其進行生物信息學分析，并使用同源建模技術模擬該蛋白催化域的三維結構，為進一步催化機理的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

假交替單胞菌(Pseudoalteromonas sp. DL-6)篩選自中國遼寧大連渤海海域近海底泥6～100 m（123。371，E，39。6972，N）；E.coli DH5α 菌株由實驗室保存；質粒pMD?19-T Vector Cloning Kit購自寶生物工程（大連）有限公司；引物合成和基因測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 培養基

LB培養基（1000 mL）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH 7.0；LB固體培養基需向液體培養基內加入 2%（w/v）瓊脂。LA培養基：LB液體或固體培養基中加入終濃度為 100 μg/mL氨芐青霉素。

1.3 低溫幾丁質酶chiA基因的克隆

按細菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取菌株Pseudoalteromonas sp. DL-6的基因組DNA。以基因組DNA為模板，根據NCBI同源序列設計簡并引物 ， 正 義 引 物 (5‘-ATGAGCTCACGKAAAATAA TAAMAAATGCC-3‘)， 反 義 引 物 (5‘-TTACAGGC TACAACTTAARSTCCAATC-3‘)，使用 TaKara LA Taq酶擴增得到低溫chiA的DNA序列；將該序列連接到pMDl9-T載體，構建pMDl9-T-chiA質粒轉化至E. coli DH5α，得到陽性轉化子。再通過 TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification試劑盒提取重組質粒，以 pMD19-T載體上的測序引物 BcaBEST Primer M13-47和BcaBEST Primer RV-M測定重組質粒的核苷酸序列。

1.4 低溫幾丁質酶chiA基因序列的生物信息學分析

序列的同源分析通過 NCBI(National Center for Biotechnology Information，http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST，http∶//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)完成。采用在線的 Simple Modular Architecture Research Tool(SMART，http∶//smart.embl-heidelberg.de/)進行序列結構域分析。采用Discovery Studio分子模擬軟件進行同源模建。

1.5 低溫chiA的同源模建

1.5.1 模板蛋白的序列搜索

利用 Discovery Studio中的 BLAST Search(DS Server)模塊，將 chiA的氨基酸序列導入模塊搜索PDB結構數據庫，搜索可以作為chiA同源建模模板的蛋白。根據搜索結果，得到與目標蛋白同源性最高的晶體結構1ITX。因此本文選取1ITX作為模板，采用同源模建的方法，構建目標蛋白的空間結構。

1.5.2 模板蛋白與目標蛋白進行序列比對

利用Discovery Studio的Align Multiple Sequences模塊進行目標序列與模板序列的多重序列比對，設置新開空位罰分 10，延續空位罰分 0.05，采用BLOSUM參數矩陣進行多重序列比對運算[11]。

1.5.3 基于目標序列與模板多重序列比對的同源模型的構建

利用 Discovery Studio平臺的 Build Homology Models模塊進行多模板序列對目標序列的同源建模，載入多重序列比對結果，打開1ITX模板的PDB文件，參數設置中，Number of Models設置為10，表示同源建模的個數為10個。Optimization Level設置為 High，表示構建模型的效果選擇最佳，這一步會造成建模時間的增加，總的建模時間2小時56分鐘。

1.5.4 對目標蛋白進行評價

通過Ramachandran plot和Profile-3D兩種方法進行模型的評價。

Ramachandran plot方法是用于闡述蛋白質或肽立體結構中肽鍵內 α碳原子和羰基碳原子間的鍵的旋轉度對α碳原子和氮原子間的鍵的旋轉度，主要用來認識蛋白質或肽類中氨基酸的允許和不允許的構象。Profile-3D方法采用3D-1D的打分函數來檢測所構建模型與自身氨基酸序列的匹配度關系。分數越高，說明同源模型的可信度越大。

2 結果與討論

2.1 低溫幾丁質酶chiA全長基因的克隆

以Pseudoalteromonas sp. DL-6菌株基因組DNA為模板，利用簡并引物chiA-F和chiA-R擴增出目的片段，大小約為3160 bp（圖1）。與預計片段大小相近，切膠回收后測序，確定為目的基因的保守片段。

圖1 低溫幾丁質酶chiA基因的電泳檢測

2.2 低溫幾丁質酶chiA基因生物信息學分析

低溫chiA全序列進行測序分析可以得出結論為：該序列全長3160個核苷酸，以ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子。該序列編碼1053個氨基酸構成的完整蛋白閱讀框，估算其分子相對質量為113.5KDa，pI值為4.49，將該基因命名為chiA，提交NCBI數據庫，登錄號為KF234015。

chiA氨基酸序列提交 SMART進行保守結構域分析，結果顯示見圖2，chiA的N端1-27位氨基酸構成信號肽，N端34-79位和C端1012-1053位氨基酸構成類型 3幾丁質結合域（type-3 chitin-binding domains，Pfam：PF02839），N 端 102-181位和 194-280位氨基酸構成成人多囊腎病結構域（Polycystic Kidney Disease，PKD），323-786位氨基酸為18家族幾丁質酶催化域（GH18 catalytic domain），795-987位氨基酸為18家族糖苷水解酶C端部分序列（Pfam：PF06483）。其中1-27位信號肽的存在表明了假交替單胞菌DL-6分泌表達幾丁質酶蛋白途徑。

圖2 chiA結構圖

本研究chiA除催化域外還包含如幾丁質結合域、成人多囊腎病結構域等結構，這些結構域的功能已有文獻報道，但機制闡述得還不是很清楚[12]。chiA在N端和C端存在兩個類型3的幾丁質結合域，根據Cazy分類歸屬于碳水化合物結合模塊 CBM5或CBM12，但因兩個家族的蛋白相近蛋白質家族數據庫（Pfam；www.pfam.org）歸為一個家族(PF02839)，即CBM_5_12。據報道其對于糖苷鍵的水解具有非常重要的作用，尤其針對于晶體粉狀幾丁質[13]，主要是其表面的色氨酸與底物作用結果。幾丁質結合域可能更利于幾丁質酶正確定位于催化域、持續的作用模式和底物脫乙酰作用等方面[14-17]，但至于該結構如何完成底物的有效降解機理并未完全闡述[15]。通常幾丁質酶只具有一個幾丁質結合域，但本研究的 chiA具有兩個幾丁質結合域，而且位于幾丁質酶的兩端，推測這種特殊的結構更利于chiA低溫下與底物緊密結合，低溫下高催化效率、增加底物的彈性降解等功能。有趣的是，本研究的chiA還具有兩個成人多囊腎病結構域，Orikoshi[18]等人報道Alteromonassp.strain O-7菌株的幾丁質酶A的N端也具有成人多囊腎病結構域，該結構域通過兩個芳香族氨基酸與底物晶體幾丁質的緊密結合而完成高效降解，該結構域不僅能與粉狀幾丁質結合還可以與纖維素和殼聚糖結合。盡管如此，chiA中的成人多囊腎病結構域是否具有同樣功能還需進一步驗證。

2.3 低溫幾丁質酶chiA的同源模建

為了確認chiA催化域保守區段和催化殘基，針對催化域利用Discovery Studio軟件進行同源模建。

2.3.1 模板蛋白與目標蛋白的序列比對

利用 Discovery Studio中的 BLAST Search(DS Server)模塊，將 ChiA的氨基酸序列導入模塊搜索PDB結構數據庫中，搜索可以作為chiA同源建模模板的蛋白結構。ChiA蛋白全序列比對未發現滿足同源模建的序列，只有催化域找到同源性較高的目標蛋白，序列比對結果見圖3。chiA與模板蛋白催化域的同源性為 29%，相似性 45%。模板蛋白為來源菌株Bacillus circulansWL-12的幾丁質酶 A1的催化域(PDB∶1ITX)滿足同源模建。

圖3 chiA與目標蛋白催化域的多重序列比對

2.3.2 基于目標序列與模板多重序列比對的同源模型的構建

如表1所示，通過Modeller構建總共10個同源建模模型，軟件在模型構建好之后會自動進行能量的打分。

表1 同源建模構建模型的結構能量得分

PDF的函數值可以直接反應出所構建模型的好壞，一般PDF Total Energy越小，表明模型能更好地滿足所提取的同源約束條件，模型的可信度也就越大。而 DOPE是一個基于原子統計勢能的程序，也主要用于模型評估。它的分數可以認為是衡量同一個分子不同構象可信度的標準，能夠幫助選擇預測結構的最優模型，分數越低，模型越可靠。結合PDF和DOPE結果我們可以發現，在軟件的自動排序中，尾數標號為 B99990002排在第一位，說明這個模型在評分中是最優的。

2.3.3 模型評價與分析

由圖4拉曼圖譜(Ramachandran Plot)[7]中可以看出藍色和紫色的區域站的比例挺大的，區域外紅色的點的誤差是在允許的范圍內，這主要是目標蛋白與所有已研究的模板蛋白同源性低的原因所在。

圖4 模型結構的Ramachandran plot圖譜

由Profile-3D結果可知，多次優化后的模型B99990002的整體結構相容性評分較高，評分值達到183.24，遠遠高于預期低評分 95.34，故可認為優化后的模型整體的相容性較為可信。

2.3.4 chiA催化域氨基酸序列分析

從圖chiA的三維結構模型可見，chiA與其他已解析的18家族幾丁質酶擁有相似的三級結構(圖5)，即(βα)8的―T IM”結構。中心部分是平行的β折疊組成的內桶，依次為β1～β8，由α螺旋將它們逐個連接起來，外桶由 α1-α8組成，內外桶緊貼在一起。α螺旋與β折疊之間由一段無規卷曲連接起來。在18家族中高度保守的兩段氨基酸片段相應于β3和β4鏈，具有相似的結構。底物結合的部位就在保守序列β3和β4鏈形成的環狀縫中。

圖5 菌株DL-6中chiA催化域同源建模結構圖

圖6 chiA催化域與其他生物體的催化域(序列來源于PDB數據庫)多重序列比對

根據chiA催化域同源模建模型，結合DNAMAN軟件對chiA編碼催化域氨基酸序列與已知晶體結構的幾丁質酶催化域的氨基酸序列進行比對分析結果(圖6)，研究chiA編碼的催化域氨基酸序列的保守氨基酸殘基信息，推測chiA催化反應機制。序列比對分析所選序列包括環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans Wl-12)菌株 Chitinase A1 的 A 鏈(PDB∶ 1ITX_A)，粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)菌株幾丁質酶B的A鏈(PDB 1E15_A)，哈氏弧菌(Vibrio Harveyi)菌株幾丁質酶 A 鏈(PDB∶ 3B8S_A)，粘質沙雷氏菌(S.Marcescens)菌株幾丁質酶A的A鏈(PDB∶ 1EDQ_A)，食線蟲真菌粉紅粘帚霉幾丁質酶Crchi1的A鏈(PDB∶3G6L_A)，人類殼三糖酶的 A 鏈(PDB∶ 1GUV_A)，哺乳動物幾丁質酶的A鏈(PDB∶ 3FXY_A)，海洋細菌(Moritella)低溫幾丁質酶的 A 鏈(PDB∶ 4HMC_A)。從圖6可見，盡管不同物種幾丁質酶的功能及編碼氨基酸序列差異較大，但其催化域的關鍵氨基酸是高度保守的。chiA具有18家族糖苷水解酶的兩個典型保守模塊，分別為99SxGG102和154DxxDxDxE161[19-21]，位于催化域的環狀縫部位，兩個保守模塊在已研究的幾丁質酶催化活性中心分別負責酶與底物結合及催化降解底物功能。

18家族幾丁質酶催化是通過―底物輔助機制”，從結構與序列比對來看本研究chiA也遵循此底物輔助雙取代水解機制，導致異頭碳的構象發生改變。154DxxDxDxE161形成即(βα)8桶的β4鏈，構成催化域的核心部位，其中谷氨酸(Glu，E161)為酶催化反應關鍵質子供體，催化水解-1亞位和+1亞位之間的糖苷鍵，而靠近谷氨酸的兩個天冬氨酸(Asp，D157和D159)在底物水解過程中也發揮關鍵作用。而 D159被認為是反應的穩定劑，氨基酸側鏈發揮以下作用：保證GlcNAc殘基的N乙酰基團正確結合在-1位，親核攻擊異頭碳的羰基氧；穩定離子中間體 oxazolinium；降低催化氨基酸谷氨酸的pKa。D157被認為是穩定劑的輔助因子，增加D159的pKa[19,22]。

3 結論與討論

近年來幾丁質酶的研究已經發展到結構與功能分析等方面，但僅依靠試驗不能獲取幾丁質酶全部功能信息，故同源建模技術成為構建幾丁質酶空間結構，預測酶功能的重要手段。本文以1ITX為模板，采用多模板同源建模的方法構建了低溫幾丁質酶chiA催化域的三維結構。Ramachandram 圖譜檢測和Verify-3D評估顯示模擬出的模型結構合理，整體的相容性較為可信。綜合序列比對、結構域分析與同源模建結果，表明chiA為糖苷水解酶18家族的一名新成員。根據chiA催化域同源構建模型結合與其他生物體18家族幾丁質酶催化域的多重序列比對結果表明，chiA具有 18家族幾丁質酶的99SxGG102和154DxxDxDxE161典型模塊，推測chiA通過―底物輔助機制”實現酶催化反應。為進一步研究低溫幾丁質催化結晶狀幾丁質結構與功能的關系提供了理論依據，同時為低溫幾丁質酶的進一步改造提供理論基礎。

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Cloning, Homology Modeling and Sequecnce Analysis of Cold-Adapted chiA

WANG Xiao-hui, CAO Hong-yu, ZHANG Qing-fang, CHI Nai-yu
（College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China）

∶A gene encoding cold-adapted chitinase (GeneBank No.KF234015) was cloned from Pseudoalteromonas sp. DL-6. This complete gene was consisted of 3,160 bp, and encoded a protein of 1,053 amino acids, the predicted molecular mass and pI were 4.49 and 113.5 kD, respectively, named chiA. The analysis of domain indicted that the chiA contained signal, two type-3 chitin-binding domains (ChtBD), two consecutive polycystic kidney disease domains (PKD), a GH18 catalytic domain and partial sequence of chic of GH18. Based on Discovery Studio we built the homology structure and refined the model of catalytic domain of cold-adapted chiA using computer modeling.The diagram of Ramachandram and Verify-3D showed that the model was in accordance with the stereochemistry,and the overall compatibility of this model was credible. The research provided theoretical basis for the further study on catalytic mechanism of cold-adapted chiA.

∶cold-adapted chiA; Pseudoalteromonas sp. DL-6; homology modeling; sequence analysis

Q93/TQ925

A

1008-2395(2015)06-0060-06

2015-03-02

王曉輝（1981-），女，講師，博士生在讀，研究方向：微生物與酶工程。