燕窩中亞硝酸鹽快速檢測技術及高靈敏試劑盒的研制

程金生 朱文娟 萬維宏

摘要：設計開發(fā)了一種亞硝酸鹽快速檢測試劑盒，并建立一種利用該試劑盒檢測燕窩中亞硝酸鹽含量的便捷方法。該方法采用大孔樹脂富集亞硝酸鹽后，再應用改進型格里斯（Griess）比色法對燕窩中的亞硝酸鹽含量進行快速準確的測定。通過觀察樣品的色階，與標準比色卡比較，判斷亞硝酸鹽含量。該試劑盒靈敏度、準確度高，快速，簡便，價廉，亞硝酸鹽最低檢測濃度可達0.1 mg/kg，可用于各類燕窩制品及火腿、罐頭、腌制品中亞硝酸鹽含量的快速檢測。

關鍵詞： 試劑盒；快速檢測；亞硝酸鹽；燕窩

中圖分類號：O656.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）13-3250-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.047

High Sensitive Analysis Technology and Kit for Rapid Detection of Nitrite

in Edible Bird′s Nest

CHENG Jin-sheng，ZHU Wen-juan，WAN Wei-hong

（Institute of Hakka Health Care， School of Medicine， Jiaying University， Meizhou 514031， Guangdong， China）

Abstract： We designed and developed a rapid detection kit for nitrite content， and established a convenient method for nitrite content by the detection kit in edible bird's nest. After enriching the nitrite by macroporous resin， then using modified Griess method to determine the content of nitrite in edible bird′s nest by colorimetric method. By observed the difference between the color gradation of sample in colorimetric tube and that of the standard colorimetric card， the content of nitrite in edible bird's nest could be determined. The detection kit in this work have high sensitivity， accuracy， rapidness， simplicity and cheapness， the lowest detection of nitrite concentration could take up to 0.1 mg/kg， which can be applied to the content detection of nitrite in various commercial products， for example， bird's nest， ham， canned food， pickled products， etc.

Key words： kit； rapid detection； nitrite； birds nest

亞硝酸鹽在中國肉制品加工生產(chǎn)中經(jīng)常被大量使用[1，2]。由于價格低廉，許多燕窩產(chǎn)品、蔬菜腌制品和瓜子炒貨產(chǎn)品都超標使用亞硝酸鹽，導致亞硝酸鹽超標嚴重。亞硝酸鹽可與食物或胃中的仲胺類物質(zhì)反應生成亞硝胺，而亞硝胺是國際公認對人體的食管癌、鼻咽癌、胃癌、膀胱癌發(fā)病密切相關。此外，該類物質(zhì)還可通過胎盤可致使胎兒畸形及中毒死亡。亞硝酸鹽的人中毒劑量為0.3～0.5 g，致死量為3 g。中國對食品中的亞硝酸鹽含量也有明確的限量規(guī)定，其中蔬菜為4 mg/kg、醬腌菜為20 mg/kg、肉制品為30 mg/kg，其他食品均小于10 mg/kg，而燕窩的限量規(guī)定是30 mg/kg[3，4]。燕窩主要產(chǎn)于中國南海諸島及東南亞各國，作為傳統(tǒng)保健品，燕窩（尤其是血燕）價格高昂，然而，卻潛伏著重大安全隱患。如浙江省工商局2011年8月15日召開的新聞發(fā)布會宣布，抽檢發(fā)現(xiàn)燕窩市場中馬來西亞產(chǎn)血燕的亞硝酸鹽含量嚴重超標，部分問題血燕產(chǎn)品含量最高達11 000 mg/kg。廣東檢驗檢疫局近年來也從一些所謂“血燕”、“黃燕”等染色燕窩中檢出高濃度的亞硝酸鹽，有的每千克中達到幾千毫克。香港科技大學抽查市面47款燕窩樣本，發(fā)現(xiàn)全部含亞硝酸鹽，最嚴重的一個血燕樣本含6 400 mg/kg，較香港肉食中亞硝酸鹽含量標準高出31倍[5]，由此可見燕窩行業(yè)亞硝酸鹽含量超標問題的嚴重性。

世界各國對亞硝酸鹽的使用范圍和使用量都有明確的規(guī)定。衛(wèi)生部2012年4月5日發(fā)出通知，食用燕窩亞硝酸鹽臨時管理限量值為30 mg/kg[6]。國際上一般參照燕窩主產(chǎn)國之一馬來西亞標準（馬來西亞食用燕窩（EBN）標準指南MS 2334：2010），其限量標準也為30 mg/kg。

目前檢測燕窩制品中亞硝酸鹽含量的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、離子色譜法（IC）、毛細管電泳法（CE）、分光光度法等。如黃艷梅等[3]成功利用離子色譜陰離子分析柱對燕窩中亞硝酸鹽進行分離測定，22 min同時完成8種陰離子的測定，取得較好的效果。李兆奎等[2]應用紫外分光光度法測定燕窩樣品中亞硝酸鹽的含量，檢測波長為538 nm，結果顯示，亞硝酸鹽的線性范圍為0～10.0 μg，平均加樣回收率97.7%，RSD為2.0%（n=5）。HPLC法、GC法、IC法及CE法等這些儀器方法檢測燕窩制品中亞硝酸鹽，優(yōu)點是檢測精確度高，缺點是檢測時間長、操作復雜、需配置較貴重儀器，甚至還需配備各種型號的色譜柱，對操作人員、維護條件也有一定要求。而分光光度法同樣需要配置專門儀器及具有一定經(jīng)驗的操作人員，因而不容易推廣[5-7]。

如今國際上日益重視應用Griess比色法來檢測食品中亞硝酸鹽含量，樣品經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，在弱酸性條件下，亞硝酸根與對氨基苯磺酸重氮化后，再與N-1-萘基乙二胺偶合形成紅色染料，即可測得亞硝酸鹽含量。如劉巖等[7]開展了香腸類肉制品中亞硝酸鹽的快速檢測法，對香腸類肉制品中亞硝酸鹽含量的定性和半定量分析的結果較為理想。一些機構研制出利用微孔板快速檢測多個樣品中亞硝酸鹽含量的新儀器，具有使用試劑量少、污染小、檢出限低、靈敏度較高、操作簡單、方便攜帶等優(yōu)點，可用于火腿中亞硝酸鹽的測定。英國Aquarium公司及美國Gatwick Koi公司等也相繼推出了水池水樣中亞硝酸鹽含量測試試劑盒產(chǎn)品[8-13]。然而，燕窩組成與其他普通食品或水樣有顯著差異，燕窩中除蛋白質(zhì)外，還有含氮物質(zhì)、膳食纖維及礦物質(zhì)等組分，樣品前處理及檢測步驟相對特殊，不可能照搬水樣、牛奶或火腿中亞硝酸鹽檢測方法及試劑盒，而且由于燕窩較其他食品價格昂貴得多，因而取樣應盡可能少。但目前國際上尚無專門快速檢測燕窩中亞硝酸鹽含量的試劑盒產(chǎn)品。國內(nèi)針對燕窩中亞硝酸鹽的快速檢測方法及試劑盒產(chǎn)品更是空白。而燕窩作為我國的傳統(tǒng)保健品，每年需求量很大，其中潛伏的亞硝酸鹽危害也很大。因此，研制專門針對燕窩制品中亞硝酸鹽含量的快速檢測方法具有重要的經(jīng)濟價值和社會意義。

本研究研制出靈敏度高、結構簡單、使用方便、價格便宜、攜帶方便的快速檢測試劑盒，應用于各類燕窩制品中亞硝酸鹽含量的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

試驗用水為去離子水， 對氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺等試劑均購自阿拉丁試劑有限公司，其余為分析純試劑。

1.2 溶液配制

1.2.1 檢測液的制備 Griess溶液A（檢測液A，對氨基苯磺酸溶液）：稱取4 g 對氨基苯磺酸溶于700 mL水和300 mL冰乙酸中，置棕色試劑瓶中混勻室溫貯存。Griess溶液B（檢測液B，N-1-萘基乙二胺溶液（1 g/L））：稱取0.1 g N-1-萘基乙二胺，加100 mL 60%乙酸溶解混勻后，置棕色試劑瓶中。將檢測液A與檢測液B等體積混合，即可制備得到Griess試劑；檢測液C：飽和硫酸鈉溶液32 mL和飽和硼砂溶液68 mL混合，置棕色試劑瓶中。

1.2.2 硼砂-氫氧化鈉溶液（pH=10）的制備 取14.768 g硼砂溶解于250 mL水中，配置成濃度為0.05 mol/L的硼砂溶液；取2.0 g氫氧化鈉，溶解于250 mL水中，配置成濃度為0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液；將50 mL的0.05 mol/L的硼砂溶液與43 mL的0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液混合，即可得pH值為10的硼砂-氫氧化鈉溶液。

1.2.3 亞硝酸鈉標準溶液的制備 準確稱取25.0 mg于硅膠干燥器中干燥24 h的亞硝酸鈉，加水溶解后移入500 mL容量瓶中，加100 mL硼砂-氫氧化鈉溶液（pH=10）緩沖液，加水稀釋至刻度，混勻，在4 ℃避光保存。此溶液相當于50 μg/mL亞硝酸鈉溶液。

1.2.4 標準比色卡的制備 準確吸取50 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液0.10、0.25、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00、13.00、15.00、17.00、20.00、21.00、23.00、25.00、27.00、30.00 mL分別置于50 mL試管中加水稀釋至刻度搖勻；各吸取1 mL上述溶液滴加在卡片（白色試紙）上，并使卡片均勻濕潤，再先后滴加0.4%對氨基苯磺酸和0.2% N-1-萘基乙二胺溶液，使其充分反應、呈色。約5 min，卡片呈現(xiàn)深淺不同色階的紫紅色；將此卡片塑封或拍成照片保存，即為標準比色卡。依照其由淺至深的色階標準比色卡所對應的亞硝酸鈉含量依次為0.10、0.25、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00、13.00、15.00、17.00、20.00、21.00、23.00、25.00、27.00、30.00 mg/kg；參照此方法，另外制備50.0、100.0、200.0及380.0 mg/kg比色卡。

2 結果與分析

2.1 檢測試劑盒的設計

本試劑盒檢測原理：亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸作用，生成不穩(wěn)定的化合物，隨即與α-萘胺作用，生成紅色偶氮化合物。根據(jù)顏色的深淺與標準比色定量。

本試劑盒是基于國標GB/T 5009.33-2003《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定方法》等標準開發(fā)的一種快速檢測試劑盒，其開發(fā)原理是采用大孔樹脂富集亞硝酸鹽后，再應用改進型格里斯（Griess）比色法對燕窩中的亞硝酸鹽含量進行快速準確的測定。即在弱酸條件下亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，再與N-1-萘基乙二胺偶合形成紫紅色染料，與標準比色卡比較定量，并且簡化前處理，提高檢測精度。而比色法原理是在相同條件下，預先配置標準溶液，按照溶液濃度與色階的對應程度，制成比色卡。取待測樣品溶液的有色溶液，將其顏色與比色卡上的色階進行比較，用目測法即可判斷出待測樣品溶液的濃度。

如圖1所示，所設計的試劑盒組成：（1）盒體：ABS、PVC、PE、PP等材質(zhì)；（2）檢測液A：10 mL；（3）檢測液B：10 mL；（4）檢測液C：50 mL；（5）吸管：玻璃材質(zhì)，2 mL，也可以用一次性塑料吸管替代；（6）玻璃樣品杯： 25 mL；（7）透明玻璃比色管：透明玻璃材質(zhì)，10 mL（刻度容量），尺寸為1.2 cm×1.0 cm× 8.5 cm（長×寬×高），柱形，上開口；（8）透明玻璃亞硝酸鹽富集柱：透明玻璃材質(zhì)，15 mL，尺寸為1.2 cm×1.0 cm× 8.5 cm（長×寬×高），圓柱形，下端有砂芯濾層，具體參見圖2；（9）大孔樹脂：國產(chǎn)D201大孔樹脂，或美國Amberlite IRA-900樹脂，也可采用德國Lewatit MP-500樹脂；（10）海綿托架：海綿材料；（11）標準比色卡：參見圖3，檢測范圍為0.1～380.0 mg/kg。

應用試劑盒檢測燕窩中亞硝酸鹽含量典型步驟：將樣品搗碎研磨，隨后稱取0.1 g于樣品杯中，加入6 mL去離子水倒入樣品杯中，加入2 mL檢測液C，攪拌均勻，靜置15 min，取上清液；取2 mL樣品上清提取液至玻璃比色管，緊接著再滴加A檢測液和B檢測液各3滴，得混合溶液；往已填裝2.5 g大孔樹脂的透明玻璃亞硝酸鹽富集柱中滴入2 mL去離子水，再將步驟2中的混合溶液倒入該玻璃富集柱中，10 min后，對著自然光觀察，將反應柱顏色與標準比色卡上的顏色比較，以確定亞硝酸鹽濃度。

圖2為所設計開發(fā)的試劑盒所用透明玻璃亞硝酸鹽富集柱直觀示意圖。該試劑盒富集亞硝酸鹽用的大孔樹脂可以是國產(chǎn)D201大孔樹脂，也可以是Amberlite IRA-900樹脂或Lewatit MP-500樹脂，每個透明反應柱一般以填充2.0～3.5 g大孔樹脂為宜，可活化后循環(huán)使用。活化工序為：將已使用過的樹脂取出，用水洗至流出清水后，用5%鹽酸浸泡4～8 h后，水洗至pH 6，再用2%～4% NaOH浸泡4～8 h，水洗至pH 7～9，待用。砂芯過濾裝置采用特硬優(yōu)質(zhì)玻璃材料，壁厚均勻，無氣泡，玻璃光潔透明，流量快，耐壓和密封性能好，尺寸規(guī)格符合國際標準，可供高溫高壓滅菌使用。

2.2 亞硝酸鹽含量檢測標準比色卡的應用

如圖3所示，觀察放樣品的透明玻璃亞硝酸鹽富集柱中的顏色，與標準比色卡比較，如果樣品比色管中的顏色與比色卡某一色階一致，則表明該樣品的亞硝酸鹽含量與對應該色階所標示的亞硝酸鹽含量一致；如果樣品溶液顏色比比色卡上某一色階深，但比鄰近的某一色階淺，則該燕窩樣品亞硝酸含量在這兩個色階對應的亞硝酸鹽含量之間。

3 小結與討論

本研究成功研制出了靈敏度高、結構簡單、使用方便、價格便宜、攜帶方便的快速檢測試劑盒，并可應用于各類燕窩制品中亞硝酸鹽含量的快速檢測。該試劑盒及檢測方法具有如下優(yōu)點：（1）取樣少。每次取樣僅需0.1 g；（2）檢測限低。本試劑盒最低檢測濃度為0.1 mg/kg；（3）檢測范圍寬。所開發(fā)試劑盒有效檢測范圍為0.1～380.0 mg/kg，較文獻報道試劑盒更寬；（4）大孔樹脂經(jīng)活化后可循環(huán)利用，有效降低試劑盒成本；（5）樣品前處理簡單，僅需將燕窩樣品用檢測液C進行處理，靜置后取樣即可；（6）燕窩樣品取樣量為0.1 g，盡量準確；取樣時，應取燕窩樣品中有代表性的部分；對檢測超標的樣品應重復檢測一次再確定；（7）靈敏度高、快速、結構簡單、使用方便、價格便宜、攜帶方便，可應用于各類燕窩制品中亞硝酸鹽含量的快速檢測，也適用于火腿、罐頭、腌制品等食品中亞硝酸鹽的檢測。

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