蘆丁通過調控TG 代謝途徑抑制肝細胞脂肪變性的作用機制研究*

潘 然，丁 濱，胡林峰，張福利，丁 蕾，方 波，謝璐帆，竇曉兵

（浙江中醫藥大學生命科學學院，浙江 杭州310053）

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是多病因引起的以肝細胞內脂質蓄積及肝細胞脂肪變性為特征的臨床病理綜合征，包括單純性非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic simple fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH），進一步可發展為肝纖維化，甚至肝癌。肝臟能利用甘油、糖、脂肪酸和甘油一酯為原料，經過磷脂酸途徑和甘油一酯途徑合成甘油三酯（Triacylgycerol，TG）；同時TG 也能在一系列脂肪酶的作用下，分解生成甘油和脂肪酸，并釋放入血供其它組織利用[1]。已知與TG 代謝相關的蛋白中二脂酰甘油酰基轉移酶（DGAT）和肉毒堿棕櫚酰轉移酶（CPT）分別是甘油三酯合成代謝、脂肪酸合成及分解代謝途徑中的限速酶。以上3 個蛋白的異常表達，直接導致肝臟細胞TG 聚積，促進NAFLD 的發生和發展。而過氧化物酶體增殖劑激活受體α（Peroxisome proliferators activated receptor α，PPAR-α）是調控基因表達的核內受體轉錄因子超家族成員之一，具有調控脂肪酸氧化等多種生物學效應。因此，本研究以蘆丁對3 個限速酶轉錄的調控及PPAR-α 調控因子表達的影響，探索蘆丁預防肝細胞中油酸誘導的TG 聚積的分子機制。

蘆丁屬黃酮類化合物，又稱蕓香苷、維生素P、紫槲皮苷，存在于蕓香葉、蕎麥花等多種植物中，具有抗炎、抗病毒作用，對脂肪浸潤的肝臟有祛脂作用，臨床上多用于治療腦溢血、高血壓、視網膜出血、紫瘢和急性出血性腎炎[2-4]。在非酒精性脂肪性肝病的中藥單藥研究中發現，以蘆丁為主要成分之一的黃酮類化合物有著突出的臨床表現[5]，具有降血糖、降血脂、保肝等作用[6-7]。已有動物實驗研究表明，蘆丁能通過降低甘油三酯，改善微循環，疏通肝內血液瘀滯以及抗氧化作用，調節機體脂代謝[8-10]進而達到防治NAFLD 的目的。但是蘆丁治療NAFLD的分子機制尚不清楚，因此用現代生物技術進一步揭示蘆丁治療NAFLD 的作用機制及靶點，對于拓展蘆丁應用的領域，探索有效預防NAFLD 的新思路具有積極科學意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

人肝細胞株HepG2 購自中科院上海細胞庫。

實驗用PPAR-α 抗體購自BOSTER（H1712），β-Actin 抗體購自Santa（B1914）。LDH 檢測試劑盒（317674）、BioEasy Master Mix （SYBR Green）（BSB25L1）均購自Thermo。BCA 試劑盒購自北京鼎國生物（BCA-01），Trizol 購自Invitrogen（103205）。蘆丁購自上海瑞永生物科技（RW95247Q301，純度≥95%），配成10mmol/L 原液待用。引物由上海生工合成，其他化學試劑購自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及模型建立

人肝細胞株HepG2 用含10%胎牛血清、青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL 的DMEM 培養液培養，37℃，5% CO2條件下培養。當培養瓶中的細胞長成80%時即可進行傳代培養[11]。

制備單細胞懸液，細胞按2×105個/mL 密度接種于24 孔培養板內，每孔1mL，將HepG2 細胞分成4 組：①空白對照組（UT）：不作任何藥物處理；②蘆丁組（Rutin）：僅用蘆丁處理；③OA 組（OA）：僅用OA 處理；④蘆丁+OA 組（Rutin+OA）：蘆丁預處理后加入OA 處理。以上4 組每組設3 個重復組，蘆丁預處理2h 后向③、④組加入0.5mmol/L OA 培養箱中培養過夜。

1.2.2 HepG2 細胞油紅O 染色

PBS 清洗2 遍，4%多聚甲醛500μL/孔固定30min；稀釋油紅儲存液：油紅∶去離子水＝3 ∶2，濾紙過濾后室溫放置10min；用過濾后的油紅O 染液500μL/孔染色10min；用60%異丙醇漂洗脫色，除去多余的染料；40 倍光學顯微鏡觀察、拍照。

1.2.3 HepG2 細胞內TG 含量測定

向油紅O 染色后的培養板內加入4% NP40 覆蓋底面，待顏色穩定后吸取200μL 上清用于測定吸光度。

從小到大，陶小西的自行車后座只有溫衡坐過，他帶她去海邊驅趕潮汐蟹，帶她去香蕉林偷香蕉，或者偷偷爬上頂樓看日出。誼愛路的居民們沒有人不認識他們，總是看見他們騎著自行車呼嘯而過，笑他們兩小無猜。

1.2.4 LDH 測定

根據LDH 檢測試劑盒說明測定細胞培養液中LDH 活性，分析各組間的細胞毒性作用。

1.2.5 實時熒光定量PCR

根據Trizol 試劑盒一步法提取細胞和組織總RNA，完成逆轉錄和實時熒光定量PCR。所用引物如表1 所示（β-actin 為內參對照）。

表1 引物序列

1.2.6 Western Blot

用裂解法提取總蛋白，用BCA 試劑盒測定濃度。將各組調整至相同蛋白濃度后，取20μg 樣本經SDS-PAGE 電泳、轉移電泳、抗體免疫（一抗分別為抗PPAR-α 蛋白、抗β-actin 蛋白）、ECL 顯影、曝光等步驟檢測蛋白表達情況（β-actin 做內參對照）。

1.3 統計學處理

利用SPSS17.0 統計軟件，數據以均數±標準差（x±s）表示，組間均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蘆丁抑制OA 誘導的HepG2 細胞內TG 的積聚

用20μmol/L 蘆丁預處理HepG2 細胞2h，再加入0.5mmol/L OA 孵育過夜，LDH 結果顯示，OA 組、Rutin 組、Rutin+OA 組這3 個處理組細胞活性與UT組相比無明顯差異（P>0.05），見圖1。OA 組細胞內TG 含量是UT 組的1.63 倍（P＜0.05），而與OA 組相比，Rutin+OA 組TG 含量顯著降低，見圖2。該試驗結果與油紅O 染色觀察到的現象相符：OA 作用16 h 后，各組細胞邊緣清晰，油紅O 染色后鏡下觀察空白對照組和蘆丁組細胞內幾乎無紅色脂滴；UT和Rutin 組細胞內幾乎無紅色脂滴；而OA 組和Rutin+OA 組細胞內紅色脂滴明顯增加，分布在靠近細胞膜的區域，呈現密集小滴狀；但與OA 模型組相比，Rutin+OA 組脂滴量則相對較少，見圖3。

圖1 對比分析蘆丁對脂肪變性HepG2 細胞毒性的影響

圖2 對比分析蘆丁對脂肪變性HepG2 細胞中TG 含量的影響

圖3 光學顯微鏡下（200×）觀察各實驗組脂肪變性HepG2 細胞TG 含量的影響

2.2 蘆丁對PPAR-α 轉錄及翻譯的影響

首先利用Real-time PCR 方法對比研究PPAR-α 在不同研究組中轉錄水平的差異。結果顯示，如圖4A，與UT 組比較，OA 組細胞內PPAR-α mRNA 表達量為62.4%，呈顯著降低（P＜0.05），而Rutin+OA 組中PPAR-α 的mRNA 表達量為284%，呈明顯增加（P＜0.05）。為了進一步探究蘆丁對PPAR-α 蛋白表達水平的影響，利用兩種不同濃度處理細胞，Western blotting 結果如圖4B，與UT 組相比，OA 組中PPAR-α 蛋白表達變化不明顯，而在兩個不同Rutin+OA 組中，該蛋白的表達增加，且與蘆丁濃度正相關。

圖4 蘆丁對脂肪變性HepG2 細胞中PPAR-α在轉錄水平和翻譯水平上的調控

2.3 蘆丁對各組細胞中CPT 和DGAT 基因轉錄的影響

CPT 是脂肪酸β 氧化途徑中的限速酶，我們首先對各試驗組中該酶的mRNA 表達情況對比分析，結果如圖5A 所示，與UT 組相比，OA 組中CPT 的兩個亞型（CPT1a 和CPT2）mRNA 表達量顯著降低（P＜0.05）；而Rutin+OA 組中兩個亞型的mRNA 表達量顯著高于OA 組（P＜0.05）。

蘆丁對預防TG 聚積的影響，即可能是促進TG的分解也可能是抑制TG 的合成（與DGAT 相關）。Real-time PCR 結 果 顯 示，OA 組 中DGAT1 和DGAT2 的mRNA 相對表達量分別是UT 組的3.75倍和3.94 倍（P＜0.05）。而Rutin+OA 組中DGAT 兩個亞型的mRNA 表達量雖未恢復到正常水平但與OA 組相比已顯著降低，見圖5B。

圖5 蘆丁對脂肪變性HepG2 細胞中CTP 及DGAT在轉錄水平的調控

3 討論

隨著生活水平的日益提高，NAFLD 患病率不斷升高，并呈低齡化發病趨勢，在發達國家，NAFLD 已成為慢性肝病及血清氨基酸轉移酶升高的首要原因，在我國僅次于病毒性肝炎[12]。NAFLD已成為全球備受關注的一大公共衛生問題，嚴重威脅著人類的生命健康。NAFLD 發病機制復雜，目前公認的是Day 的“二次打擊學說”[13]，其中“二次打擊”以脂質過氧化、內質網應激和線粒體功能損傷為主。已有多篇文獻報道，PPAR-α 的表達量與NAFLD 存在一定的關聯[14-17]：肝臟脂肪酸水平的增高激活PPAR-α 后，誘導脂肪酸氧化的基因轉錄，增加對脂肪酸氧化的能力，進而降低脂質在肝臟的沉積，在調節細胞脂肪酸代謝的各個環節中占有重要地位[18-21]。Ying Cai 等人[22]的研究發現，蘆丁能夠顯著減少db/db 小鼠肝細胞內脂滴的積聚，降低TG 的含量，同時在小鼠的肌肉組織檢測到高濃度的PPAR 族蛋白。Cheng-Hsun W[23]等人報道，蘆丁能夠通過減少脂質積累和氧化應激反應來降低HepG2 細胞內TG 的積累。本研究也在細胞水平證明了這一結果，并且還進一步發現蘆丁能夠促進PPAR-α 在轉錄和翻譯水平上的表達，提示其可能通過PPAR-α 來調控細胞內脂肪酸代謝，進而降低TG 在肝細胞內的積聚。CPT 是線粒體內脂肪酸β-氧化反應的限速酶，分CPT1 和CPT2 兩類。CPT1 位于線粒體內膜外側，催化長鏈脂肪酸從酰基輔酶A 轉移到肉毒堿上進而從胞漿進入線粒體內部，并且進一步在位于線粒體內膜上的CPT2 催化下進行β 氧化[24-27]。我們推測蘆丁通過PPAR-α 激活CPT 的轉錄。為證實我們的推測，我們檢測了蘆丁對細胞內CPT 轉錄的影響。發現僅用蘆丁處理反而會抑制CPT 的轉錄，且其抑制效率較OA 更強。但同時加入蘆丁和OA 處理的細胞中CPT 的轉錄又得以恢復。體現出中醫中以毒攻毒，否極泰來的用藥理念。然而與我們的預測不同，蘆丁僅僅通過PPAR-α 恢復了原有受抑制的CPT 的轉錄。

除了降解途徑，影響肝臟內TG 含量的另一個因素是脂肪酸以及TG 的合成。DGAT 是TG 合成的限速酶，分DGAT1 和DGAT2 兩種亞型，能催化二酰甘油和脂肪酸酰基生成三酰甘油的反應，在TG合成中起到了至關重要的作用。該酶在細胞中的濃度與脂肪代謝、脂類在脂肪中的沉積、血漿中TG 的濃度有很大關系。Kong L[28]、Charles A[29]等實驗證明DGAT 在肝臟中的過表達能使細胞溶質中積累脂質，并利用內源性的單不飽和脂肪酸合成TG[30-31]。在我們的研究中檢測了各試驗組細胞中DGAT 的mRNA 表達量，發現蘆丁能夠顯著抑制油酸誘導的細胞內DGAT1 和DGAT2 的基因轉錄，從而抑制了OA 誘導的TG 的合成。

綜上所述，蘆丁能夠降低脂肪變性HepG2 細胞TG 含量，在轉錄和翻譯水平上增加細胞內PPAR-α的表達。并且能夠激活脂肪酸代謝途徑中CPT 的表達，同時抑制TG 合成過程途徑中DGAT 的表達。我們推測蘆丁是通過增加細胞內PPAR-α 的表達，恢復脂肪變性肝細胞中脂肪酸的正常氧化代謝、抑制脂肪酸的合成，進而減緩OA 誘導的肝細胞中TG的積累。同時蘆丁通過抑制DGAT 的轉錄，減緩了脂肪變性感細胞中TG 過量的合成。可見，蘆丁對脂肪變性肝細胞脂質代謝的影響并不是單一的，可能涉及多種方式多條通路，具體機制還有待在后續的研究中闡明。

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