白及須根醇提物誘導肺腺癌細胞A549 凋亡研究*

蔣瑞彬，黃晶晶，李浩宇，潘 平，蔣福升，錢朝東，丁志山

（浙江中醫藥大學，浙江 杭州310053）

肺癌是我國最常見的癌癥之一，其中非小細胞肺癌占原發癌的75%～80%[1]。細胞凋亡是細胞的程序性死亡，在正常組織及腫瘤組織都廣泛存在，它對維持機體的穩定起到非常重要的作用[2]。近年來，隨著的對凋亡機制的研究，發現凋亡與腫瘤細胞的發生及發展中存在密切的關系，誘導細胞的凋亡成為目前研究腫瘤的靶點之一，也成為評價腫瘤治療效果的指標之一。白及學名Bletilla striata（Thunb.）Reichb.F.，為蘭科多年生草本球根植物，以干燥的塊莖入藥，用于治療咯血，吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂等癥[3]。有文獻報道，白及含有的薜藶果糖可抑制腫瘤細胞的增長[4]。研究還發現，白及黏液質對大鼠瓦克癌（W256）、小鼠子宮癌（U14）、小鼠艾氏腹水癌、肝癌和肉瘤180 均有抑制作用。這可為白及用于臨床治療腫瘤疾病提供新的理論依據[5]。但全世界對于白及的研究還是很少，特別是抗腫瘤相關的研究，其活性成分和相關的藥理作用還有待于我們繼續研究[6-7]。

隨著中國對于中醫藥事業的重視，白及在臨床的需求越來越多，用藥量不斷增加[8]。白及的野生資源越來越少，已被列為國家瀕危珍稀保護植物名錄[9]。白及的藥用部位為塊莖，而在實際的操作過程中，白及的須根被大量浪費，在土地干旱的地區，白及的須根與塊莖的比例達到1∶3～1∶4[10]。研究發現，人參總皂苷在主根的含量為5.22%，但須根卻達到11.52%[11-12]，而人參總皂苷是人參的有效成分之一。單從人參皂苷含量看，須根的藥用價值比人參主根高。因此，本研究將觀察白及塊莖和白及須根醇提物對肺腺癌細胞A549 增殖凋亡及相關機制的影響，并比較它們對A549 細胞抑制增殖的作用能力，以探討白及醇提物在誘導肺癌細胞凋亡的分子機制。

1 材料

1.1 藥材

白及購自浙江中醫藥大學飲片廠，白及塊莖及白及須根醇提物由本實驗室制備。

1.2 試劑

RPMI 1640 培養基（美國GIBCOBRL 公司，批號：13112105）、胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批號：130407）；Hoechst 33342 染料（Sigma P4170）、PI 染料（Sigma P2261）；青霉素鈉鹽（華北制藥有限公司，批號：1104303）；鏈霉素（華北制藥有限公司，批號：1107106）；胰蛋白酶（杭州宏博生物工程有限公司，Amresco 分裝）；二甲基亞砜（DMSO）（天津市永大化學試劑有限公司，批號：20120323）。

1.3 儀器

萬分之一精密電子天平（AR2130 Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；二氧化碳細胞培養箱（Thermo Electron Corporation HEPA CLASS100）；倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS IX71）；酶標儀（Labsystems Wellscan Mk3）；流式細胞儀（GAVUA INSYTE 5）；熒光定量PCR 儀（StepOnePlusTM，USA）。

1.4 細胞株

肺腺癌細胞A549 由浙江中醫藥大學生物技術研究所提供。

2 方法

2.1 增殖抑制實驗

將經含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養的肺腺癌細胞A549 制成3×104mL-1細胞懸液，按每孔100μL 接種于96 孔板，于37℃含5% CO2培養箱中孵 育 24h， 吸 掉 原 培 養 液， 用 不 同 濃 度（10，20，30，40，50，60μg·mL-1），每孔100μL 的白及塊莖醇提物和須根醇提物分別處理24、48h 后，結束前4h 加入1.9mg·mL-1的MTS 液20μL，繼續培養4h，于酶標儀490nm 波長處測定吸光度（A）值，重復3 次。細胞抑制率=（1-A加藥/A對照）×100%，取3個重復孔為平均值，計算白及塊莖醇提物與須根醇提物作用24、48h 的細胞成活率，實驗重復3 次。

2.2 Hoechst-PI 雙染白及塊莖醇提物與須根醇提物誘導肺腺癌細胞A549 凋亡的影響

將細胞以3×103/孔接入到96 孔細胞培養板中，待其生長24h 貼壁后， 更換含有濃度為30，40，50μg·mL-1；白及塊莖醇提物與須根醇提物的RPMI 1640 培養液，在37℃、5%CO2培養箱中培養48h，PBS 洗2 遍，分別加入Hoechst 與PI 溶液常溫避光孵育10min，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞。

2.3 FITC 標記的Annexin-V/PI 雙染流式細胞術分析

取經藥物處理的A549 細胞用不含EDTA 的胰酶消化收集，用PBS 洗滌細胞2 次（2 000r/min 離心5min） 收集2×105細胞，加入500μL 的Binding Buffer 懸浮細胞，加入5μL Annexin V-FITC 混勻后，加入5μL Propidium Iodide，混勻，之后室溫避光反應10min，立即用流式細胞儀檢測Annexin VFITC 陽性（早期凋亡）和Annexin V-FITC/PI 雙染陽性（晚期凋亡）細胞百分率。

2.4 二維水平細胞遷移實驗

將A549 制成2×104mL-1細胞懸浮液，按苗孔1mL 接到24 孔細胞培養板中，于37℃含5% CO2培養箱中孵育24h，待細胞在培養板上形成均勻的一層，用10μL 的移液器吸頭在培養板的中軸線輕輕劃上一橫，用PBS 洗去細胞殘骸。分別加入含有濃度為30，40，50μg·mL-1白及塊莖醇提物與須根醇提物的培養液培養，在0，12，24，48h 用倒置顯微鏡觀察細胞的遷移情況，利用目鏡的刻度尺測靈劃痕的寬度（S），每個孔分別測量5 個點（兩端，中間，左1/4，右1/4），最后平均值。細胞遷移率的計算公式如下：

細胞遷移率=（S零時間點-S測量點）/S零時間點×100%

2.5 RT-PCR 法檢測Bcl-2、Bax、ICAM-1 基因的mRNA 表達量

細胞分別經過30，40，50μg·mL-1白及須根醇提物處理48h 后用胰酶消化離心后，采用Trizol 法提取細胞的總RNA，后采用M-MLV 逆轉錄酶進行逆轉錄，采用熒光定量PCR 擴增Bcl-2、Bax、ICAM-1，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內參，引物參考文獻[13]中的序列，引物由上海生工生物技術公司合成。Bcl-2 引物序列：上游引物為5’-TgTgTgTggAgAgCgTCAACC-3’，下游引物為5’-TTCAgAgACAgCCAggAgAAATC-3’；Bax 引物序列：上游引物為5’-TCAggATgCgTCCACCAAgAA-3’，下游引物為5’-TCCCggAggAAgTCCAATgTC-3’；ICAM-1引物序列：上游引物為5’-TAgCCAACCAATgTgCTATT-3’，下 游 引 物 為5’-CAgCgTAgggTAAggTTCTTg-3’；內參（GAPDH）序列為：上游引物為5’-ATT CAACggCACAgTCAAgg-3’，下游引物為5’-gCAgAAggggCggAgATgA-3’。在熒光定量PCR 儀中設置一下參數：94℃預變性1 min；94℃變性20 sec，55℃退火20 sec，72℃延伸20 sec，讀板，共40 個循環；融解曲線。得到每個樣品的Ct 值，以空白對照組為對照，以GAPDH 為內參基因，計算每個樣品的目的基因的相對表達量2-△△Ct。

△△Ct =[待測組目的基因平均Ct 值-待測組內參基因平均Ct 值]-[對照組目的基因平均Ct 值-對照組內參基因平均Ct 值]。

2.6 結果統計

采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示，采用方差分析來比較各組間的差別有無顯著性統計學差異。

圖1 白及須根醇提物及塊莖醇提物對A549 細胞增殖的影響

3 結果

3.1 白及塊莖醇提物及須根醇提物對肺腺癌細胞株A549 的增值影響。

隨著藥物濃度的提高，白及塊莖醇提物與須根醇提物都能明顯降低細胞的存活率，有明顯的劑量依賴關系。由圖1 可以看出，在相同的作用時間和藥物濃度的情況下，白及須根醇提物抑制A549 細胞的增值效果明顯好于白及塊莖醇提物。

圖2 Hoechst-PI 雙染白及須根醇提物誘導肺腺癌細胞A549 凋亡的影響

3.2 Hoechst-PI 雙染白及須根醇提物誘導肺腺癌細胞A549 凋亡的影響

通過Hoechst-PI 雙染結果可知，隨著藥物濃度的升高，細胞的形態發生了明顯的變化。對照組細胞呈梭形或橢圓形，胞漿飽滿，核區染色均勻，給藥組隨著濃度升高，凋亡細胞明顯增多。在藥濃度為40μg·mL-1時，細胞出現凋亡，細胞皺縮，核區體積變小，Hoechst 染色可見致密濃染熒光。在藥濃度為50μg·mL-1時，細胞開始大量死亡，PI 染色后可見強紅色熒光，見圖2。

3.3 FITC 標記的Annexin-V/PI 雙染流式細胞術

由圖3 可知，白及須根醇提物誘導A549 細胞株Annexin-FITC 陽性（早期凋亡）和Annexin VFITC/PI 雙染陽性（晚期凋亡）細胞百分率增高，呈現出濃度依賴性。

3.4 白及須根醇提物對A549 遷移的影響

由圖4 可知，與對照組相比，當細胞給予30，40，50μg·mL-1的白及須根醇提物時，48h 時A549 細 胞 的 遷 移 率 分 別 為65.1% 、50.93% 、24.17%，說明在48h 內白及須根醇提物可以明顯的抑制住A549 在二維水平上的移動。

3.5 白及須根醇提物對肺腺癌A549 細胞Bcl-2、Bax、ICAM-1 基因mRNA 的影響

實驗結果顯示白及須根醇提物能夠有效的降低ICAM-1 及bcl-2 基因mRNA 相對表達量，并且隨著藥物濃度的增加而降低，而促進細胞凋亡的基因bax 隨著藥物濃度的增加其表達量增加，呈現濃度依賴效應。這就說明白及須根醇提物能夠通過抑制bcl-2 基因的表達，降低Bcl-2 與Bax的比率來誘導肺腺癌細胞的凋亡，也能通過抑制ICAM-1 基因的表達來抑制A549 肺腺癌細胞的轉移和粘附見圖5。

圖3 Annexin-V/PI 雙染細胞流式儀分析

圖4 不同濃度白及須根醇提物對A549 細胞二維水平遷移的影響

4 討論

白及作為我國的傳統中藥材，是治療肺胃出血的要藥，說明白及的作用靶點主要為肺與胃。本研究利用肺腺癌細胞，發現白及的須根醇提物對于抑制A549 細胞增殖的效果明顯好于白及的塊莖醇提物，本研究還發現白及須根醇提物能減少Bcl-2 基因的表達，降低Bcl-2 與Bax 的比率來誘導肺腺癌細胞的凋亡，同時通過減少ICAM-1 基因的表達來抑制腫瘤細胞的遷移。而在實際操作過程中，白及的須根作為邊角料而被大量的丟棄，根據我們的研究結果，這為以后白及的綜合利用開發奠定基礎。

圖5 不同濃度白及須根醇提物A549 細胞中ICAM-1、bcl-2、bax 表達的影響

細胞凋亡出現的一個重要癥狀是細胞的通透性增強，并且凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受損而不能將Hoechst 33342 染料排出細胞外，因此Hoechst 33342 能夠進入到凋亡細胞要比正常細胞要多，使熒光增強，而PI 染料不能進入具有完整細胞膜的正常細胞和凋亡細胞。通過Hoechst 與PI 的雙染我們就很清楚的區分開正常細胞、凋亡細胞與死亡細胞。細胞的凋亡還受到很多基因的控制，Bcl-2 基因是研究最早于凋亡相關的基因，也是目前研究最熱的關于調控細胞凋亡的基因，Bcl-2 主要是通過形成同源二聚體或異源二聚體來調控細胞的凋亡，當Bax 形成同源二聚體誘導細胞凋亡，Bax 就能與Bcl-2 形成異源二聚體來實現Bcl-2 抑制細胞凋亡的功能[14]。在線粒體上的Bcl-2 至少在以下兩個水平來調節細胞的凋亡：①通過改變線粒體膜上的電位來調控細胞的凋亡。因為在細胞的凋亡過程中，線粒體的疏基會成為包內氧化還原電位的傳感器，Bcl-2 就可以抑制谷胱甘肽的外泄來降低胞內的氧化還原電位，從而抑制細胞的凋亡。②Bcl-2 能夠調節線粒體膜上對某些蛋白前體的通透性，Bax 能在較廣泛的pH 范圍內形成離子孔道，它能允許小分子或者是離子穿過線粒體膜進入細胞質，從而引起細胞的凋亡，而Bcl 的作用相反，它能關閉Bax 形成的通道，抑制細胞的凋亡，通過Bcl-2與Bax 的比率來調控細胞凋亡[15]。而ICAM-1 是一種細胞黏附因子，它在人體的正常細胞內一般很少表達或不表達，但在一些腫瘤細胞中ICAM-1 會過表達，所以它在腫瘤細胞的轉移和黏附過程中起到很重要的作用[16]。

綜上所述，白及塊莖及其須根的醇提物都能促進肺腺癌細胞A549 的凋亡，且須根的效果要好于塊莖，所以白及須根具有一定的開發利用價值，值得進一步研究。

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