辛開苦降法對脾胃濕熱證大鼠胃黏膜上皮細胞p53、Bcl-2 蛋白的影響*

鄭春素，陳錦芳

（福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建 福州350122）

王氏連樸飲具有清熱利濕的功效，為辛開苦降法的代表方劑，本研究以復合因素誘導復制大鼠脾胃濕熱證模型，通過胃腸病理取材確定胃黏膜病變程度，檢測p53、Bcl-2 蛋白等指標，觀察王氏連樸飲治療后的變化情況，嘗試從分子生物學角度觀察脾胃濕熱證的本質并揭示王氏連樸飲的相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SPF 級SD 大鼠60 只，雄性，體重（200±20）g。（購自福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心，合格證：SCXK（閩）20150002）。傷寒沙門氏菌濃度：109CFU/mL（購自廣東省微生物研究所）。AvantiTM230 型超速冷凍離心機由美國BECKMAN 公司生產(chǎn)，即用型P53-抗體與Bc1-2-抗體由武漢博士德生物有限工程公司提供，酶標定量測定儀由德國Thermo 公司生產(chǎn)。奧美拉唑（北京康蒂尼藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：040321）規(guī)格：20mg/片（購于福建省第二人民醫(yī)院西藥房）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脾胃濕熱證模型的制作

造模前各組動物禁食12h，自由飲水。正常組大鼠以基礎飼料喂養(yǎng)26 d，并生活在20～28°C、50%～70%相對濕度環(huán)境。其余5 組參照陳佩嬋[1]等人的脾胃濕熱證造模方法，給予高脂高糖飼料（普通飼料中混入12%豬油，8%蜂蜜加工而成）進行喂養(yǎng)，10 d后在溫度（33±2）℃，相對濕度75%±5%的環(huán)境中生活，共7 d，然后以鼠傷寒沙門氏菌灌胃，劑量為10mL/kg，24 h 后再次灌胃，劑量為5mL/kg。

1.2.2 王氏連樸飲藥物的制備

參照《霍亂論》原方中藥物比例：蘆根60g，制厚樸6g，香豉、焦山梔各9g，川連、石菖蒲、制半夏各3g。以上藥物均由福建省第二人民醫(yī)院中藥房提供。上述藥物浸泡20min，入水量以覆蓋藥面2cm為度，先武火后文火煎煮約20min，濾去藥渣取澄清藥液。煎煮2 次后混勻并濃縮，保存在4°C 冰箱。

1.2.3 分組與給藥

大鼠分籠適應性喂養(yǎng)3 d 后，60 只SD 大鼠隨機分成正常組，生理鹽水組、奧美拉唑組、王氏連樸飲高、中、低劑量組6 組，每組10 只。正常對照組和模型組給予等容積生理鹽水，西藥組給予奧美拉唑濃縮液（1g/kg）灌胃；王氏連樸飲高、中、低劑量組分別按照不同濃度王氏連樸飲濃縮液（根據(jù)《中藥藥理研究方法學》中實驗動物（按大鼠200g 體質量計算）與人（70kg）的體表面積比轉換公式，5 倍給藥，王氏連樸飲高、中、低劑量組濃度為16.2g/kg，8.1g/kg，4.1g/kg。）10mL/kg 體質量灌胃。每日1 次，連續(xù)灌胃1 周。

1.2.4 標本采集

末次給藥后，各組大鼠不禁水，禁食12h，然后腹腔注射10%水合氯醛，大鼠麻醉后，剪取胃竇、大腸、十二指腸組織適量，于4%多聚甲酸溶液中，固定24h 以上，脫水，浸蠟，包埋，3μm 切片，HE 染色。

1.2.5 Bcl-2、P53 蛋白指標檢測

釆用免疫組化SABC 法檢測大鼠胃黏膜Bcl-2、P53 蛋白的表達水平，染色具體操作參照試劑說明書。以PBS 代替一抗作陰性對照，以已知的陽性切片做陽性對照。結果判斷：細胞胞核呈棕黃色為p53 核表達呈陽性，細胞胞膜和胞漿呈棕黃色為Bcl-2 表達呈陽性。

1.2.6 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0 軟件處理。計數(shù)資料用百分數(shù)表示，采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 胃、十二指腸、大腸黏膜組織形態(tài)變化

HE 染色后，正常對照組大鼠胃黏膜層結構完整，大腸、十二指腸柱狀上皮結構完好，絨毛排列緊密。生理鹽水組大鼠胃黏膜組織表現(xiàn)為水腫和充血等改變，中性粒細胞、嗜酸性粒細胞可于黏膜下層和固有層中見到；大腸、十二指腸可見黏膜組織充血水腫，上皮脫落、壞死，炎細胞浸大量潤。與生理鹽水組相比，奧美拉唑組、王氏連樸飲高、中、低劑量組大鼠胃黏膜、十二指腸絨毛上皮結構均完好（見圖1）。

2.2 各組大鼠Bcl-2，P53 蛋白的變化

生理鹽水組Bcl-2、P53 蛋白表達較正常組明顯增加，差異明顯，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與生理鹽水組相比，奧美拉唑組、王氏連樸飲（高、中、低）劑量組Bcl-2，P53 蛋白表達降低，但王氏連樸飲低劑量組與奧美拉唑組間無顯著性差異（P>0.05），王氏連樸飲高劑量組優(yōu)于中低劑量組及奧美拉唑組，組間有顯著性差異（P＜0.05），見表1。

圖1 胃、十二指腸的組織學觀察（×200）

表1 各組大鼠Bcl-2、P53 蛋白的變化

3 討論

脾胃濕熱證在臨床中極為常見，既可由從外感受濕熱之邪所致，也可因脾胃虛弱或過食肥甘厚味、辛辣刺激之物，致使?jié)駸醿忍N中焦而成，病勢纏綿，病程較長，難以速愈。無論從理論還是臨床中，辛開苦降法對脾胃濕熱證的治療作用已經(jīng)得到了共識。王氏連樸飲出自王孟英的《霍亂論》，全方寒溫互用，為辛開苦降的代表方，治療脾胃濕熱證具有較好的效果。

現(xiàn)代研究證實胃黏膜結構的完整性主要是由胃黏膜上皮細胞增殖、凋亡的平衡維持[2-5]。胃黏膜上皮細胞過度凋亡參與了胃黏膜損傷的發(fā)生過程。細胞凋亡是一個受基因調控的細胞主動死亡過程，涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用。現(xiàn)代學者通過對胃腸道黏膜上皮細胞凋亡機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)胃腸道上皮細胞丟失的主要途徑為細胞凋亡；胃腸道上皮細胞凋亡與胃腸疾病的發(fā)生關系密切；細胞凋亡的調控主要有抑制細胞凋亡、促細胞凋亡、協(xié)助細胞凋亡三種基因[6-8]。脾胃濕熱證與消化系統(tǒng)疾病關系最為密切[9-15]，本研究表明模型組Bcl-2，P53 蛋白表達明顯增加，說明脾胃濕熱證的病變過程中細胞凋亡起了一定的作用，奧美拉唑組及王氏連樸飲各劑量組治療后均較治療前Bcl-2，P53 蛋白表達下降，說明藥物對脾胃濕熱證的改善機制可能通過影響細胞凋亡途徑發(fā)揮作用，王氏連樸飲高劑量組的Bcl-2，P53 蛋白表達與正常組無顯著差異，與王氏連樸飲中、低劑量相比，有顯著差異，說明王氏連樸飲對脾胃濕熱證的作用更加突出，從分子生物學角度探討辛開苦降法治療脾胃濕熱證的的作用機制有助于更好地研究治療脾胃濕熱證的藥物。

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