消腫方對骨關節炎家兔軟骨細胞凋亡及同源細胞群數量的影響*

李 亮，劉安平，周正新，周章武，江樹連，盛炎炎

（安徽中醫藥大學第一附屬醫院骨傷科，安徽 合肥230031）

有研究表明，軟骨細胞凋亡是骨關節炎（Osteoarthritis，OA）關節軟骨退變的關鍵因素之一[1]，軟骨細胞過度凋亡，數量過少，引起細胞外內環境穩態的改變，又使軟骨細胞的凋亡增加，形成惡性循環，從而導致OA 的發生[2]，消腫方是根據我院骨傷科國家級名老中醫丁鍔教授根據“補腎活血利水”法組成的中藥復方，以補腎活血利水為主，臨床用于治療OA，多年的臨床觀察結果顯示其有較理想的治療效果[3]。前期研究顯示：補腎活血利水法具有促進軟骨細胞增殖、抑制其凋亡、調控滑膜組織基因表達譜及多種細胞信號通路等多種作用[4]，為了進一步探討其療效機制，揭示其發揮療效的藥理作用特點或靶點，本研究通過建立兔OA 動物模型，觀察不同濃度消腫方對動物模型的軟骨細胞凋亡及同源細胞群數量的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6 月齡體重2.6～3.2kg 的新西蘭大耳白兔36只，雌雄各半，隨機分為6 組（模型組、空白組、陽性對照組，中藥消腫方低劑量組（40g/kg）、中劑量組（80g/kg）、高劑量組（160g/kg），每組6 只，實驗動物均購自安徽中醫藥大學動物實驗中心，普通級，實驗動物許可證號：SYXK（皖）2013-0126。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

Bcl-2、Bax 免疫組化試劑盒和軟骨細胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德公司）。

1.2.2 主要儀器

37℃溫箱（上海三發科學儀器有限公司 型號：GNP-9160 型），干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司 型號：DHG-9140 型），石蠟切片機（Leica2135），BM-Ⅱ型病理組織包埋機（安徽省電子科學研究所），ZT-RP 生物組織脫水機、QP 切片漂烘溫控儀（湖北省孝感市亞光醫用電子技術有限公司），88-1大功率磁力攪拌器、QT-1 漩渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司），LX-100 手掌型離心機（上海市麒麟醫用儀器廠），Nikon80 熒光顯微鏡（新飛達光學儀器公司）。

1.3 實驗藥物

消腫方劑生藥飲片由安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供（懷牛膝15g，茯苓皮20g，黃芪15g，當歸10g，莪術8g，萆薢10g，紅花2g 組成），將生藥飲片80g 加入920g 水中制備成中劑量組，低、高劑量組分別將生藥飲片40g，160g 加入960、840g水中制備成低、高劑量組；鹽酸氨基葡萄糖規格：0.24g*28 片/盒，四川新斯頓藥業生產，產品批號為：141004。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模

除空白組外，所有動物采用改良Hulth 法[5]制作膝關節OA 動物模型，麻醉生效后，常規消毒、鋪巾，取兔膝關節前內側髕旁入路，切開皮膚及皮下組織后，內側支持帶及關節囊后，將髕骨向外側脫位，顯露膝關節腔，顯露內側半月板及前交叉韌帶，依次切除內側半月板，切斷內側副韌帶，切斷前交叉韌帶（改良Hulth 法），再逐層關閉關節囊、皮下組織、皮膚，敷料包扎切口，不予外固定，建模后連續4d青霉素3×104U 肌肉注射，10d 后開始每天強迫兔活動40min，連續6 周。

1.4.2 實驗分組與給藥

隨機分為6 組后，根據人與兔體表面積比值，人與兔藥物劑量比值為1/3，分別對消腫方低劑量組、中劑量組、高劑量組采用40、80g/kg 以及160g/kg 的消腫方煎劑20mL 灌胃，空白組灌服等容積生理鹽水，陽性對照組灌服溶有6 片硫酸氨基葡萄糖的生理鹽水溶液（1d 分3 次），連續治療4 周。

1.4.3 檢測指標和檢測方法

1.4.3.1 組織形態學檢查

光鏡下觀察軟骨細胞、軟骨陷窩、軟骨囊、同源細胞群及軟骨細胞間質形態、結構和數量的變化，在10×40 光鏡視野下觀察，任選5 個視野觀察，每個視野計數同源細胞群數量。

1.4.3.2 細胞凋亡檢測

采用TUNEL 法（原位缺口末端標記法）在10×40 光鏡視野下觀察，任選5 個視野觀察，平均計數100 個軟骨細胞中細胞核染色成棕色顆粒的細胞數目即為凋亡指數（AI）。

1.4.3.3 免疫組化檢測

標本石蠟切片，免疫組織化學染色（三步法）：石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育5～10min，以消除內源性過氧化物酶的活性。PBS（磷酸鹽緩沖液）浸泡5min×2 次，5%～10%正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1～2h 或4℃過夜。PBS 沖洗，5min×3 次。滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃孵育10～30min。PBS 沖洗，5min×3 次。滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30min。PBS 沖洗，5min×3 次。顯色劑顯色DAB（磷酸緩沖液）3～15min 自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。在光鏡下觀察Bcl-2 蛋白陽性表達為漿黃色顆粒，試驗以己知陽性染色切片作為陽性陽性對照，以磷酸緩沖液代替第一抗體作為陰性陽性對照，在400 倍放大率下，任選5 個高倍鏡視野，計算Bcl-2 陽性細胞所占百分比。

1.5 統計方法

所有數據應用SPSS 17.0 軟件包進行統計學分析，參數值用均數±標準差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔膝關節軟骨細胞形態學觀察（HE 染色，10×40 倍）

圖1 空白組

圖2 模型組

圖3 陽性對照組

圖4 治療組（低劑量組）

圖5 治療組（中劑量組）

圖6 治療組（高劑量組）

由圖1-6 可知，空白組：軟骨細胞結構清晰、排列規則，軟骨陷窩及軟骨同源細胞群數量多，軟骨細胞間質少，模型組：軟骨細胞形態不規則、排列雜亂，軟骨陷窩及軟骨同源細胞群數量很少；軟骨細胞間質很多，治療組：軟骨細胞結構較清晰、排列較規則，軟骨陷窩及軟骨同源細胞群數量少，軟骨細胞間質多，介于空白組和模型組之間。

2.2 軟骨同源細胞群數量比較

由表1 統計結果顯示：同一時間段，在不同組別兩兩比較，高劑量治療組與中劑量治療組相比較時，P>0.05，4 周時陽性對照組與模型組比較時，P>0.05，8 周及12 周時中劑量治療組與低劑量治療組相比較時，P>0.05，其他組別兩兩比較時，P＜0.05。統計結果表明：模型組軟骨同源細胞群數量降低，治療后，軟骨同源細胞群數量升高，在治療早期（4周），隨中藥劑量由低劑量組到中劑量組增加時，其升高幅度加大，有統計學意義，但經過治療8 周及12 周后，隨中藥劑量增加時，雖升高幅度加大，無統計學意義。

在各組隨時間變化（4 周，8 周，12 周）兩兩比較后統計結果為：空白組（P＜0.05），模型組（P＜0.05），陽性對照組（P＜0.01），治療組（低劑量組）（P＜0.01），治療組（中劑量組）（P＜0.05），治療組（高劑量組）為0.058，0.003，0.005，實驗結果表明：除高劑量治療組由4 周延長至8 周時，軟骨同源細胞群數量增加不明顯外，其余各組實驗動物隨時間延長，出現軟骨同源細胞群數量增加，有統計學意義。

2.3 采用TUNEL 法檢測軟骨細胞凋亡指數

由表2 可知，在同一時間軟骨細胞凋亡指數隨不同組別變化兩兩比較后統計結果為：4 周、8 周、12 周時P＜0.05。實驗結果表明：模型組軟骨細胞凋亡指數明顯升高，而經過中藥消腫方治療后，軟骨細胞凋亡指數下降，而且隨中藥劑量增大，其下降幅度加大，有統計學意義。

在各組隨時間變化（4 周，8 周，12 周）兩兩比較軟骨細胞凋亡指數后統計結果為：空白組8 周與4周相比，P=0.175，12 周與8 周相比，P=0.025＜0.05，模型組和陽性對照組8 周與4 周相比，P=0.025＜0.05，12 周與8 周相比，P=0.695，在低、中、高劑量治療組8 周與4 周相比，12 周與8 周相比，P＜0.05。實驗結果表明：空白組軟骨細胞凋亡指數在12 周時明顯升高，模型組和陽性對照組軟骨細胞凋亡指數在8 周時明顯升高，超過8 周后，升高不明顯，治療后，軟骨細胞凋亡指數下降，在各劑量治療組，隨治療時間由4 周逐漸延長至8 周、12 周時，其下降幅度加大，有統計學意義。（見圖7-12）

表2 軟骨細胞凋亡指數

圖7 空白組

圖8 模型組

圖9 陽性對照組

圖10 低劑量治療組

圖11 中劑量治療組

圖12 高劑量治療組

2.4 BCL-2 陽性細胞百分比

由表3 可知，在同一時間軟骨細胞BCL-2 陽性細胞百分比隨組別變化兩兩比較后統計結果為：4周、8 周、12 周時P＜0.05。實驗結果表明：模型組BCL-2 陽性細胞百分比最低，隨組別變化至陽性對照組、低、中、高劑量治療組時，軟骨細胞BCL-2 陽性細胞百分比逐漸升高，而且隨中藥劑量增大，其升高幅度加大，有統計學意義。

在各組隨時間變化（4 周，8 周，12 周）兩兩比較后統計結果為：空白組12 周與8 周相比，P＜0.05，其余5 組8 周與4 周相比，12 周與8 周相比，P＜0.05。實驗結果表明：隨時間延長，各組實驗動物均出現BCL-2 陽性細胞百分比明顯升高，有統計學意義。（見圖13-18）

表3 BCL-2 陽性細胞百分比

圖13 空白組

圖14 模型組

圖15 陽性對照組

圖16 低劑量治療組

圖17 中劑量治療組

圖18 高劑量治療組

3 討論

OA 發病率高，是老年人的最常見的慢性關節疾病，尤以膝關節OA（KOA）常見。北京市區的調查結果顯示60 歲以上老年人膝關節X 線OA 患病率女性為42.8%，男性為21.5%；臨床KOA 患病率女性為15%，男性為5.6%[6]。

OA 指由多種因素引起關節軟骨纖維化、皸裂、潰瘍、脫失而導致的關節疾病。目前病因尚不明確，其發生與年齡、肥胖、炎癥、創傷及遺傳因素等有關。其病理特點為軟骨蛋白多糖含量減少，導致軟骨破壞，進而全層軟骨消失，深達骨質，關節邊緣骨贅形成，軟骨下骨增厚、囊性變、硬化，滑膜呈慢性炎癥改變，同時滑膜釋放細胞因子，進一步破壞軟骨[7]，其病變涉及整個滑液關節，包括軟骨、滑膜和軟骨下骨、其發病過程最主要的特點是以膝關節軟骨的退行性改變和繼發性骨質增生為主要病理改變，表現為關節間隙變窄，軟骨下骨硬化[8]，OA 的發病機制尚不完全清楚，研究表明細胞外基質的降解、軟骨細胞凋亡等是該病發生的重要因素。

同源細胞群是由一個軟骨細胞分裂增殖形成的軟骨細胞群，位于軟骨組織的中部。每個同源細胞群有2～8 個軟骨細胞，包含在一個大的軟骨陷窩內，后者又分成幾個小的陷窩，各含一個軟骨細胞。軟骨的同源細胞群深層的軟骨組織內軟骨陷窩較少，但形態較大，內含多個軟骨細胞，但細胞較成熟，代謝緩慢，越靠近軟骨的中部，同源細胞群的數目越多，反映了軟骨細胞外基質的生長，同源細胞群的數目下降，則表明細胞外基質的降解，目前對于同源細胞群數目的相關研究較少，因此關于這方面的研究有待進一步開展。

軟骨細胞凋亡在OA 病理過程中發揮的作用越來越受到重視[9]，細胞凋亡（細胞程序性死亡）是一個主動的、信號依賴的過程，并由基因控制的主動的、高度有序的死亡過程。線粒體凋亡、內質網應激性凋亡、細胞自噬在OA 的發病過程中發揮重要的調控作用[10]。因此關于軟骨細胞凋亡的實驗研究成為目前的熱點之一。目前有研究表明Bcl-2 家族是調節細胞凋亡相關蛋白中的關鍵調因子，其抗凋亡與促凋亡成員協調作用[11]，Bcl-2 家族蛋白的一個顯著特征是具有Bcl-2 同源結構域，主要體現在4個保守的區域，即BH1、BH2、BH3、BH4 結構域，典型的抗凋亡成員如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Bcl-W 等含有4 個短的保守的BH 結構域和一個C 端疏水尾狀結構，即跨膜結構域，這類成員具有抗凋亡活性，在免疫調節中發揮重要作用。

KOA 屬中醫“痹證”范疇，是臨床難治性疾病之一，晚期致殘率高，多數患者最終需要人工關節置換以改善功能，所以本病治療的關鍵在于早期防治[12]，從西醫來說，即使僅以緩解癥狀、改善功能為目的，也缺少療效更好、不良反應更少的治療方法，因此中醫藥治療骨關節炎已經逐漸受到重視。中醫對其認識歷史悠久，治療手段多樣，有臨床效果好、副作用少等優勢[13]。中醫認為中老年膝骨關節炎的主要病機是肝腎不足，氣虛血瘀，虛損與瘀實并存，虛損為本，成其病，瘀實為標，其病在筋骨，與肝腎密切相關[14]，消腫方是根據我院骨傷科國家級名老中醫丁鍔教授根據“補腎活血利水”法組成的中藥復方，有補腎利水、活血化瘀之功，對痰、瘀、水互阻所致的骨關節炎能起較好的治療作用[15]。

氨基葡萄糖是構成關節軟骨的內源性物質，可刺激黏多糖的生化合成及增加骨骼鈣質的攝取，以提高骨與軟骨組織的代謝功能和營養，同時改善與增強滑膜液的黏稠度，增加滑膜液合成，提供關節潤滑功能，還可阻斷OA 的病理過程，防止疾病進展，抑制和消退關節變性形成，從而有效修復軟骨關節，持久緩解疼痛，阻止疾病進展，具有優越的耐受性和安全性，臨床廣泛用于骨關節炎的治療，是第一個經臨床證明的骨關節炎疾病改善藥物[16]，因此在本研究中作為陽性對照藥物。

在制作模型方法上，本研究采用經典的改良Hulth 法建立骨關節炎家兔模型，通過切除內側半月板，切斷前交叉韌帶、內側副韌帶造成膝關節的不穩，使關節軟骨承受了異常的機械壓力，從而導致軟骨退變及破損[17]，并且采取強迫活動方式誘導模型建立。兔膝骨關節炎模型中關節內手術方法，如改良Hulth 法等模型誘導成功率高，穩定性好，應用廣泛，特別適用于膝關節內注藥預防和減輕OA病理改變的研究[18]。

本實驗研究表明：空白組軟骨細胞凋亡指數在12 周時明顯升高，模型組和陽性對照組軟骨細胞凋亡指數在8 周時明顯升高，超過8 周后，升高不明顯，而經過中藥消腫方治療后，軟骨細胞凋亡指數下降，其下降幅度與治療時間以及中藥劑量有相關性，消腫方具有抑制軟骨細胞凋亡作用；模型組軟骨同源細胞群數量降低，在治療早期（4 周），隨中藥劑量由低劑量組到中劑量組增加時，其升高幅度加大，有統計學意義，但經過治療8 周及12 周后，隨中藥劑量增加時，雖升高幅度加大，無統計學意義，除高劑量治療組由4 周延長至8 周時，軟骨同源細胞群數量增加不明顯外，其余各組實驗動物隨時間延長，出現軟骨同源細胞群數量增加，有統計學意義，表明消腫方能增加軟骨同源細胞群數量，并與治療時間以及中藥劑量有相關性；模型組BCL-2 陽性細胞百分比最低，通過消腫方治療后，軟骨細胞BCL-2 陽性細胞百分比逐漸升高，表明消腫方能升高BCL-2 陽性細胞百分比，并且其升高幅度與治療時間以及中藥劑量有相關性；但其抑制軟骨細胞凋亡與升高同源細胞群數量及BCL-2 陽性細胞百分比內在關系以及是否通過某些信號通路發揮其干預作用，尚有待進一步研究證實。

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