甘草藥材HPLC 指紋圖譜研究*

謝佳穎，楊立國，夏偉軍，張海元，張英杰，梅雙喜

（云南省藥物研究所/云南白藥集團創新研發中心/云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室，云南 昆明650111）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖，春、秋二季采挖，除去須根，曬干。其性平、味甘，歸心、肺、脾、胃經，具有補脾益氣、清熱解毒之功效，臨床上廣泛應用于脾胃虛弱，倦怠乏力等證[1-2]。

甘草是云南省藥物研究所研制的“金品”痛舒膠囊、腫痛氣霧劑等產品的重要原料之一[3]，但由于藥材受氣候等生態環境的影響，不同批次藥材所含化學成分差別較大。為了有效的控制各批次甘草藥材的質量，我們運用HPLC 方法對同一產地10 批次甘草藥材進行了指紋圖譜測定，為甘草藥材質量的有效控制奠定了方法基礎。

1 儀器和材料

Thermo UltiMate 3000 高效液相色譜儀（Ultimate-3000 RS 四元泵、WPS-3000 自動進樣器、TCC -3000 SD 柱 溫 箱、DAD -3000 檢 測 器、ChromeLeon 7.0 色譜工作站）；SK8200HP 超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；瑞士Mettler Toledo AG285 電子天平；甘草苷（111610-200503）購自中國食品藥品檢定研究院；甘草酸（130109）和異甘草苷（130418）購自北京萬佳首化生物科技有限公司；芹糖甘草苷和異甘草素葡萄糖芹菜苷為本研究室從甘草藥材中提取分離得到[4-5]；甘草藥材（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）購自內蒙古，經云南省藥物研究所邱斌高級工程師鑒定，標本保存于云南省藥物研究所標本室；乙腈為色譜級，水為實驗室自制重蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法和結果

2.1 液相色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序見表1。流速為1mL/min，各時間段檢測波長為：0～16 min，215 nm；16～22 min，360 nm；22～70 min，250 nm，柱溫為30 °C，進樣量為10 μL，檢測時間為70 min。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 混合對照品溶液的制備方法

分別稱取異甘草素葡萄糖芹菜苷、異甘草苷、芹糖甘草苷、甘草苷和甘草酸適量，加入70%乙醇制成每毫升含上述各對照品20 μg 的混標溶液，搖勻，備用。

2.3 供試品溶液的制備方法

取甘草藥材粉末約0.1 g，置60 mL 具塞錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，加入70%乙醇補足減失的重量，搖勻后，使用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，備用。

2.4 方法學驗證

2.4.1 精密度考察

取1 號供試品溶液，連續進樣6 次，記錄高效液相色譜圖，計算各個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，計算RSD 值。各共有峰相對保留時間的RSD 為0.02%～0.35%（表2），各共有峰相對峰面積的RSD 為0.03%～0.13%（表3），表明儀器性能較好，符合指紋圖譜相關要求。

表2 相對保留時間（將3 號峰的相對保留時間定為1.000）

表3 相對峰面積（將3 號峰的相對峰面積定為1.000）

2.4.2 穩定性試驗

取1 號供試品溶液，分別在制備后的0，2，4，8，12，24 h 進樣，記錄高效液相色譜圖，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，計算RSD 值。各共有峰相對保留時間的RSD 為0.05%～1.84%（表4），各共有峰的相對峰面積的RSD 為0.02%～0.83%（表5），表明供試品溶液在24 h 內穩定，符合指紋圖譜相關要求。

表4 相對保留時間（將3 號峰的相對保留時間定為1.000）

表5 相對峰面積（將3 號峰的相對峰面積定為1.000）

2.4.3 重復性試驗

取1 號甘草藥材，按2.3 項下供試品的制備方法制備6 份供試品溶液，分別進樣，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，計算RSD 值。各共有峰相對保留時間的RSD 值為0.05%～1.47%（表6），各共有峰相對峰面積的RSD 值為0.05%～0.36%（表7），表明供試品溶液的制備方法重復性較好，符合指紋圖譜相關要求。

表6 相對保留時間（將3 號峰的相對保留時間定為1.000）

表7 相對峰面積（將3 號峰的相對峰面積定為1.000）

2.5 指紋圖譜及相似度計算

2.5.1 十批甘草藥材指紋圖譜的測定

按2.1 項下HPLC 條件測定同一產地10 批次甘草藥材的高效液相色譜指紋圖譜，采用藥典委員會推薦使用的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件進行分析，得到了不同批次甘草藥材指紋圖譜的共有譜圖，并確定了7 個共有色譜峰（見圖1）。

2.5.2 同一產地10 批次甘草藥材指紋圖譜相似度計算

采用藥典委員會推薦使用的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件，計算得到了同一產地10批次甘草藥材指紋圖譜的相似度，其相似度均在0.95 以上，表明同一產地不同批次甘草藥材的相似度滿足要求（見圖2）。

2.6 甘草藥材部分特征峰的化學指認

取1 號供試品溶液及混合對照品溶液進樣，根據各個對照品的色譜保留時間可以對甘草藥材的部分色譜峰進行指認，峰2 為芹糖甘草苷，峰3 為甘草苷，峰4 為異甘草素葡萄糖芹菜苷，峰5 為異甘草苷，峰6 為甘草酸（見圖3）。

圖1 甘草藥材HPLC 對照指紋圖譜

圖2 同一產地10 批次甘草藥材HPLC 指紋圖譜

圖3 混合對照品（上圖）和甘草藥材（下圖）的HPLC 圖譜

3 討論

①本研究對甲醇、乙腈和酸水系統進行了摸索，發現乙腈-0.05%磷酸水系統分離情況較好，各色譜峰均達到比較好分離，故確定乙腈-0.05%磷酸水系統作為甘草藥材液相色譜指紋圖譜的流動相。

②實驗過程中考察了3 種不同提取方式（超聲、冷浸和回流），發現3 種提取方式的提取效率相似，故最終選擇操作簡便的超聲作為藥材的提取方式。

③根據二極管陣列檢測器全波長掃描給出的各指標成分的最大吸收波長可知：芹糖甘草苷和甘草苷（2 號峰和3 號峰）的最大吸收波長為215 nm，異甘草素葡萄糖芹菜苷和異甘草苷（4 號峰和5 號峰）的最大吸收波長為360 nm，甘草酸（6 號峰）的最大吸收波長為250 nm。所以，確定各時間段的檢測波長如下：0～16 min，215 nm；16～22 min，360 nm；22～70 min，250 nm。

④甘草藥材中的主要化學成分包括黃酮類、三萜類、多糖類和生物堿類[6-10]，具有鎮咳平喘、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等作用[11-15]。上述黃酮類和三萜類化學成分很可能是云南省藥物研究所研制的“金品”痛舒膠囊、腫痛氣霧劑等產品的活性成分，本研究所建立的甘草藥材的HPLC 指紋圖譜方法，對上述黃酮類和三萜類化學成分進行了測定，可用于甘草藥材的質量控制，為實現“金品”痛舒膠囊、腫痛氣霧劑等產品質量的均一、穩定奠定了方法基礎。

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