白及薄層色譜鑒別方法的改進(jìn)和高效液相指紋圖譜研究*

楊順麗，楊枝中，李 龍，彭曉麗，梅雙喜

（云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心/云南省藥物研究所/云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650111）

中藥白及為蘭科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.的干燥塊莖[1]，為《中國(guó)藥典》2010年版一部收載品種。其味苦、甘、澀，微寒，歸肺、肝、胃經(jīng)，具有收斂止血，消腫生肌的功效，用于治療咳血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂；肺結(jié)核咳血，潰瘍病出血[2]。臨床上白及被應(yīng)用于治療口腔潰瘍、燒燙傷和皮膚病外，還拓展到前列腺手術(shù)、肛腸病、婦科肌瘤以及腫瘤栓塞治療[3-4]。近幾年國(guó)內(nèi)外研究表明白及塊莖中分離得聯(lián)芐類(lèi)、菲類(lèi)、聯(lián)菲類(lèi)、聯(lián)菲醚類(lèi)、菲并吡喃類(lèi)、聯(lián)芐葡萄糖苷類(lèi)、菲并螺甾內(nèi)酯類(lèi)以及甾體、三萜和花色素苷類(lèi)等化合物[5-10]。白及是云南省藥物研究所研制的腫痛氣霧劑等產(chǎn)品的重要原料之一，筆者對(duì)原料藥質(zhì)量控制研究中發(fā)現(xiàn)，2010 年版《中國(guó)藥典》對(duì)白及的質(zhì)量控制僅有薄層色譜鑒別，且方法繁瑣、效果不理想。筆者優(yōu)化了白及薄層鑒別條件，改進(jìn)了薄層鑒別方法，獲得了較好的結(jié)果，使白及藥材的薄層色譜鑒別簡(jiǎn)便、快速；同時(shí)建立了白及藥材HPLC 指紋圖譜鑒別方法，為進(jìn)一步完善白及藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、加強(qiáng)白及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-2010 高效液相色譜儀（日本島津公司）；SK8200HP 型超聲波震蕩器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；Mettler Toledo AG 285 電子分析天平（十萬(wàn)分之一）；Heidolph Laborata 4000-efficient 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；可調(diào)式封閉電爐（FL-北京光明醫(yī)療儀器有限公司），Milli-Q? Advantage A10? systerm 超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司），乙腈為色譜純（Merck KGaA）；水為自制超純水；甲醇、環(huán)己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、硫酸等試劑均為分析純。

白及對(duì)照藥材（批號(hào)：121262-201104），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；1，4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋(píng)果酸酯對(duì)照品（militarine，批號(hào)：14040233，含量：98.0%），購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。

白及藥材（批號(hào)：BJ-002，BJ-003，BJ-003，BJ-004，BJ-005，BJ-006，BJ-007，BJ-008，BJ-009，BJ-010，BJ-011），采自云南省蒙自縣冷泉鎮(zhèn)，經(jīng)云南省藥物研究所邱斌高級(jí)工程師鑒定為蘭科植物白及Bletilla Striata（Thunb.）Reichb.f.的干燥塊莖，標(biāo)本保存于云南省藥物研究所標(biāo)本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別改進(jìn)

按照2010 版《中國(guó)藥典》白及鑒別項(xiàng)下方法[1]，對(duì)白及藥材進(jìn)行薄層鑒別，該方法耗時(shí)長(zhǎng)，薄層色譜清晰度差，如圖1 所示。

圖1 白及薄層色譜圖（藥典方法）

2.1.1 溶液制備

供試品溶液的制備：取白及粉末1g，加甲醇20mL，超聲處理（功率350W，頻率53Hz）30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL 溶解，作為供試品溶液。

對(duì)照藥材溶液的制備：取白及對(duì)照藥材1g，按“供試品溶液的制備”方法制成對(duì)照藥材溶液。

2.1.2 鑒別

吸取供試品溶液與對(duì)照藥材溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠板上，以三氯甲烷-甲醇-水（6∶0.5∶0.05）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果表明，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)，如圖2 所示。

圖2 白及薄層色譜圖（改進(jìn)方法）

2.2 HPLC 指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件

色譜柱為T(mén)hermo Acclaim 120 C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～15min，18%～30%A；15～60min，30%～50%A；60～65min，50%～18%A）；柱溫：25℃；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取militarine 對(duì)照品適量，加甲醇溶解制備成濃度為1mg/mL 的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取白及粉末（過(guò)三號(hào)篩）1.0g，置具塞錐形瓶中，精密稱(chēng)定，加入70%甲醇溶液25mL，稱(chēng)重，超聲處理（功率350W，頻率53Hz）30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度試驗(yàn)

取同一份供試品（BJ-002）溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定指紋圖譜，結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間≤0.32%，相對(duì)峰面積RSD≤0.91%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品（BJ-002）溶液，分別于0、3、6、9、12、24h 進(jìn)樣，測(cè)定指紋圖譜，結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD≤0.53%，相對(duì)峰面積RSD≤2.43%，表明供試品溶液在24h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批白及藥材（BJ-002）6 份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并測(cè)定指紋圖譜，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD ≤0.45%，相對(duì)峰面積RSD≤1.80%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.5 白及藥材HPLC 指紋圖譜的建立

10 批白及藥材樣品按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定指紋圖譜，見(jiàn)圖3，通過(guò)圖譜比較，確定11 個(gè)色譜峰為共有峰。Militarine 為白及藥材的活性成分之一[11]，且含量較高，以它為參照峰計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積（見(jiàn)表1，表2），militarine 對(duì)照品HPLC 色譜圖見(jiàn)圖4。

2.2.6 白及藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

將10 批白及藥材的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004 A 版），自動(dòng)匹配后生成對(duì)照?qǐng)D譜（見(jiàn)圖5），進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，不同批次白及藥材指紋圖譜相似度均大于0.95，說(shuō)明不同批次白及藥材中化學(xué)成分相似度較高，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 不同批次白及藥材HPLC 指紋圖譜

圖4 參照峰militarine HPLC 色譜圖

表1 10 批白及藥材共有峰的相對(duì)保留時(shí)間（將3 號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間定為1.00）

表2 10 批白及藥材共有峰的相對(duì)峰面積（將3 號(hào)峰的相對(duì)保留時(shí)間定為1.00）

圖5 白及藥材HPLC 特征圖譜

表3 10 批白及藥材樣品相似度

3 討論

2010 版《中國(guó)藥典》中白及薄層鑒別采用的展開(kāi)劑，即環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇（6∶2.5∶1），在室溫較高時(shí)，易揮發(fā)，比例容易發(fā)生變化，影響薄層展開(kāi)的重現(xiàn)性。在薄層鑒別方法改進(jìn)實(shí)驗(yàn)中，筆者摸索了多種展開(kāi)劑，最終認(rèn)為文獻(xiàn)[12]報(bào)道的展開(kāi)劑三氯甲烷-甲醇-水（6∶0.5∶0.05）展開(kāi)效果最好，并改用1%香草醛硫酸乙醇溶液為顯色劑，薄層色譜圖清晰，斑點(diǎn)分離良好，解決了藥典方法鑒別耗時(shí)長(zhǎng)，色譜圖清晰度差的問(wèn)題。此外，改進(jìn)了供試品溶液制備方法，結(jié)果表明白及藥材粉末加適量甲醇超聲處理，即可獲得與藥典方法一致的薄層色譜，省去了萃取等繁鎖操作，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了工作效率。

在HPLC 指紋圖譜研究中，參照文獻(xiàn)[13-15]選擇流動(dòng)相系統(tǒng)乙腈-水，考察了不同吸收波長(zhǎng)210、254、270nm 下的指紋圖譜，結(jié)果表明，檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm 下色譜圖基線(xiàn)較為平穩(wěn)，各色譜峰的分離良好，且峰面積較為適宜。供試品溶液制備比較了超聲和回流提取方法，結(jié)果表明采用超聲的方法色譜圖主成分峰面積略比回流提取大，且方法簡(jiǎn)便、快捷；同時(shí)考察了采用50%甲醇溶液、70%甲醇溶液、甲醇超聲提取制備供試品溶液，結(jié)果表明，70%甲醇溶液超聲提取的色譜峰信息量大，主成分峰面積最大，因此選擇70%甲醇提取樣品。此外，柱溫考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)成分峰的分離效果受柱溫影響較大，柱溫30℃時(shí)兩峰重疊，25℃和35℃時(shí)分離良好，且出峰順序相反，25℃時(shí)各色譜峰分離度較35℃好，因此，將柱溫固定為25℃。

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