四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠二肽基肽酶4活性變化

稅迎春，夏欣一，章 瓊，張 承，吳元赭

·論 著·

四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠二肽基肽酶4活性變化

稅迎春1，夏欣一2，章 瓊1，張 承1，吳元赭1

目的 觀察四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠體內二肽基肽酶4（DPP4）酶活性變化。方法 建立四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠模型，檢測大鼠血漿及部分組織中DPP4酶活性變化，同時檢測血漿總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、胰島素和活性胰高血糖素樣肽?1（GLP?1）水平變化。結果 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠糖耐量和胰島素耐量顯著異常。血漿、肺、肝和回腸DPP4活性顯著升高，其吸光度值分別由（0．10±0．01）、（0．16±0．02）、（0．15±0．01）和（0．17±0．01）升高到（0．20±0．04）、（0．18± 0．03）、（0．19±0．02）和（0．19±0．02）。血漿胰島素和活性GLP?1水平顯著降低，分別由（1．22±0．41）ng／L和（3．11±1．20）pmol／L下降到（0．71±0．31）ng／L（P＜0．01）和（2．03±0．93）pmol／L（P＜0．05），而血漿TC和TG水平顯著升高，分別由（3．23± 0．62）mmol／L和（1．01±0．10）mmol／L升高到（5．32±1．41）mmol／L（P＜0．01）和（1．83±0．41）mmol／L（P＜0．01）。結論 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠糖耐量和胰島素耐量顯著異常，血脂升高，胰島素降低，血漿及部分組織DPP4酶活性升高，從而導致血漿活性GLP?1水平下降。

四氧嘧啶；糖尿病妊娠大鼠；二肽基肽酶4；活性GLP?1；胰島素

二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）是目前糖尿病藥物開發中最熱門的靶點之一，目前已有多個DPP4抑制劑上市，用于糖尿病的治療，效果十分顯著。四氧嘧啶（alloxan，ALX）糖尿病大鼠模型是目前糖尿病研究中廣泛應用的動物模型之一，對此模型的特征及其發病機制也已有許多研究報道。目前國內外尚未見有關于四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠體內DPP4酶活性的研究報道。本研究觀察四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠體內DPP4酶活性變化情況，以進一步了解四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠的生物學特征。

1 材料與方法

1.1 試劑 四氧嘧啶、甘氨酸對硝基苯胺（gly?Pro?p?nitroanilide）和Hepes緩沖液購自Sigma公司。血糖、三酰甘油（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度膽固醇（high?density lipo?protein cholesterol，HDL?C）、低密度膽固醇（low den?sity lipoprotein cholesterol，LDL?C）和糖化血紅蛋白（haemoglobin A1C，HbA1c）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。大鼠超敏胰島素ELISA試劑盒為ALPCO公司產品。活性GLP?1（glucagon like peptide?1）ELISA試劑盒購自Millipore公司。葡萄糖等其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器 μ?Quant酶標儀為美國Bio?Tek公司產品，3?18k離心機為德國Sigma公司產品。

1.3 實驗動物 SPF級WISTAR大鼠，體重250g左右，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號為SCXK（京）2002?0003。所有動物均飼養于SPF級動物房。

1.4 實驗方法

1.4.1 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠模型建立 WISTAR大鼠28只，禁食（不禁水）12 h后，按70 mg／kg體重尾靜脈注射四氧嘧啶，6 d后測空腹血糖，以血糖值14～ 26 mmol／L為糖尿病大鼠。

1.4.2 口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT） 動物禁食4 h后，進行口服葡萄糖耐量試驗［1］。測定空腹血糖（0 min）及葡萄糖（2．0 g／kg）負荷后30、60和120 min時的血糖值，并計算血糖曲線下面積（AUC）。

1.4.3 胰島素耐量試驗（insulin tolerance test，ITT） 進行OGTT 1周后，動物禁食4 h，皮下注射常規胰島素溶液（0．4 U／kg）［1］。于注射前（0 min）和注射后40、90 min采血樣，測定各時間點的血糖值，并計算血糖曲線下面積（AUC）。

1.4.4 血漿DPP4活性測定 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠禁食4 h，尾尖采血樣，室溫放置30 min后，6000×g離心1 min。反應底物甘氨酸對硝基苯胺工作液用Hepes緩沖液（pH 7．05）配制，濃度為0．30 mmol／L。取10 μL血漿，加入40 μL底物工作液和50 μL Tris／HCl緩沖液（pH 8．0）。在37℃條件下，檢測反應60 min內波長405 nm吸光度值的變化［2］。

1.4.5 組織DPP4酶活性測定 －80℃保存的組織樣品于冰上融化。稱取0．1 g組織，加于500 μl Tris／HCl緩沖液（pH 8．0）中剪碎，200 w，10 s／次，2次，超聲粉碎。然后于4℃，12 000×g離心10 min。取上清，再于12 000×g離心20 min。獲取上清用于測定。采用考馬斯亮藍法測定其蛋白濃度。選擇Tris／HCl緩沖液（pH 8．0）稀釋上清，使各樣品蛋白濃度一致。取10 μL稀釋上清，加入40 μL底物工作液（濃度為0．30 mmol／L）和50 μL Tris／HCl緩沖液（pH 8．0）。在37℃條件下檢測反應60 min內 405 nm處吸光度的變化［2］。

1.4.6 血漿TC、TG、胰島素和活性GLP?1水平測定 按照試劑盒說明書進行。

1.5 統計學處理 采用SPSS 13．0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗，所有數據經正態性和方差齊性檢驗，采用多因素方差分析方法分析，以P＜0．05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠OGTT變化 與正常對照大鼠相比，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠空腹血糖值（0 min）顯著升高，升高達283．4%（P＜0．01）。口服糖負荷后，30、60和120 min血糖值也顯著升高（P＜0．01），且OGTT曲線下面積（AUC）也顯著升高（P＜0．01）。表明四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠糖耐量顯著異常。

2.2 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠ITT變化 正常大鼠皮下注射胰島素后，血糖下降十分顯著，并且血糖恢復也比較迅速，而四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠皮下注射胰島素后，血糖變化并不顯著，提示四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠胰島素耐量顯著異常。

表1 四氧嘧啶（ALX）糖尿病妊娠大鼠OGTT結果

表2 四氧嘧啶（ALX）糖尿病妊娠大鼠ITT結果

2.3 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿及部分組織DPP4活性變化 與正常大鼠相比，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿DPP4活性顯著升高，升高達100．0%（P＜0．01），同時四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠肺、肝和回腸組織中DPP4活性也顯著升高，分別升高了12．5%（P＜0．05）、26．7%（P＜0．01）和11．7%（P＜0．05）。

表3 四氧嘧啶（ALX）糖尿病妊娠大鼠血漿及部分組織DPP4活性變化（吸光度值）

2.4 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿胰島素、活性GLP?1、TC和TG水平變化 與正常大鼠相比，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿胰島素和活性GLP?1水平顯著降低，分別下降了41．8%（P＜0．01）和34．7%（P＜0．05），而TC和TG水平顯著升高，分別升高了64．7%（P＜0．01）和81．2%（P＜0．01）。但HDL?C、LDL?C和HbA1c水平無明顯變化。

表4 四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿胰島素、活性GLP?1、TC和TG水平變化

3 討 論

四氧嘧啶是胰島β細胞毒劑，通過產生H2O2等超氧自由基，選擇性不可逆地破壞胰島β細胞，作用迅速而強烈，使胰島分泌功能喪失，造成內分泌功能紊亂，糖、脂肪、蛋白質等的代謝失調，從而導致負氮平衡，使機體消瘦而體重下降，甚至引起動物死亡［3］。由四氧嘧啶誘導的動物糖尿病模型與人類1型即胰島素依賴性糖尿病類似。四氧嘧啶價格低廉，造模成功率高，死亡率低，模型穩定，因此四氧嘧啶誘導的動物糖尿病模型在抗糖尿病及降血脂藥物研發中應用十分廣泛。

DPP4是多功能的以同源二聚體形式存在的高特異性絲氨酸蛋白酶，廣泛分布于肝、腎、腸、脾臟、腎上腺等組織中，存在于許多類型細胞表面，包括淋巴細胞、上皮細胞和內皮細胞等。DPP4可以以膜結合型和可溶型2種形式存在，膜結合型DPP4被酶切后，即變為可溶型形式進入循環系統。DPP4可以剪切N端的第二位為丙氨酸或脯氨酸的多肽，體內很多活性多肽，如神經肽、趨化因子、細胞因子等都是DPP4的底物［4］。

腸促胰島素在糖尿病發生發展中起重要作用。GLP?1為20世紀80年代發現的腸促胰島素，攝食后由腸道L細胞分泌。GLP?1的主要作用包括刺激胰島素生物合成和葡萄糖誘發的胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，提高β細胞對血糖的反應，促進β細胞增殖并抑制其凋亡，延緩胃排空和減少肝糖輸出等。研究表明GLP?1對妊娠期糖尿病患者的血糖和胰島功能有改善作用［5?6］，但GLP?1極易被DPP4降解而失活，體內半衰期僅有2 min左右［7?8］。因此研究者試圖直接補充或通過抑制DPP4活性來間接提高血液中GLP?1的量來治療糖尿病［7?8］。

有關動物模型中DPP4活性的研究并不多。鏈脲菌素（Streptozotocin，STZ）誘導的C57糖尿病大鼠、高脂加STZ共同誘導的WISTAR糖尿病大鼠、高脂或高果糖喂養的F334／Jcl大鼠的血漿DPP4活性均顯著升高［9?11］。高脂和STZ聯合誘導的SD糖尿病大鼠以及長期高脂喂養的SD大鼠的腸、肝臟和腎臟組織DPP4活性和表達均顯著升高［12］。谷氨酸誘導的胰島素抵抗大鼠的空腹血糖正常，但血清、肝臟和回腸DPP4酶活性及含量均顯著升高。有研究表明2型糖尿病患者體內DPP4活性顯著升高［13］，但是也有研究顯示2型糖尿病患者體內DPP4活性是降低的［14?15］。有研究指出高血糖并不是引起DPP4活性升高的誘發因素，糖耐量異常和胰島素抵抗才可能對DPP4酶活性升高起重要作用［16?19］。

本研究發現，和正常大鼠相比，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠脂質代謝、糖耐量和胰島素耐量顯著異常，空腹血糖顯著升高，表現出顯著的1型糖尿病特征。四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿DPP4活性顯著升高，同時肺臟、肝臟和回腸中DPP4活性也顯著升高。由于四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠DPP4活性升高，導致血漿中活性GLP?1降解加速，血漿中活性GLP?1濃度下降，進一步導致胰島素分泌減少，血漿中胰島素濃度下降，更進一步加重了大鼠糖尿病癥狀。本研究結果提示，四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠血漿及部分組織DPP4活性顯著升高，血漿活性GLP?1及胰島素水平顯著下降。該結果為探討妊娠糖尿病的致病機制提供了試驗依據。下一步我們將對四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠DPP4活性顯著升高的可能機制進行研究與探討，以豐富四氧嘧啶糖尿病妊娠大鼠的生物學特征。

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Changes of DPP4 enzyme activity in alloxan?induced diabetic pregnant rat

SHUI Ying?chun1，XIA Xin?yi2，ZHANG Qiong1，ZHANG Cheng1，WU Yuan?zhe1． 1．Department of Gynaecology，2．The People's Lib?eration Army Inspection Institute for Medical Research Nanjing，Nanjing General Hospital of Nanjing Mlitary Region，Nanjing，Jiangsu 210002，China

Objective To study changes of DPP4 enzyme activity in alloxan induced diabetic pregnant rat．Methods Dia?betic rat were induced by alloxan，DPP4 enzyme activities of plasma and some tissues were determined．At the same time，the plasma insulin，TG，TC and active GLP?1 levels were also determined．Results There were obvious impaired glucose tolerance and insulin tolerance in alloxan induced diabetic pregnant rat．In alloxan induced diabetic pregnant rat，DPP4 enzyme activities of the plasma，lung，liver and ileum increased from（0．10±0．01），（0．16±0．02），（0．15±0．01）and（0．17±0．01）to（0．20±0．04），（0．18±0．03），（0．19±0．02）and（0．19±0．02），respectively．At the same time，plasma insulin and active GLP?1 levels declined from（1．22±0．41）ng／L and（3．11±1．20）pmol／L to（0．71±0．31，P＜0．01）ng／L and（2．03±0．93，P＜0．05）pmol／L respectively，but plasma TC and TG increased from（3．23±0．62）mmol／L and（1．01±0．10）mmol／L to（5．32±1．41，P＜0．01）mmol／L and（1．83±0．41，P＜0．01）mmol／L respectively．Conclusion In alloxan induced diabetic pregnant rat，glucose tolerance and insulin tolerance were abnormal sig?nificantly，accompanied with hyperlipidemia and hypoinsulinemia．DPP4 enzyme activities of the plasma and some tissues increased，then caused plasma active GLP?1 level decreased significantly．The results of the study can provide the experimental basis for the patho?genic mechanism of gestational diabetes mellitus research．

alloxan；diabetic pregnant rat；DPP4；active GLP?1；insulin

R587．1

A

10．3969／j．issn．1672?271X．2015．06．003

∶2015?08?19；

∶2015?08?27）

江蘇省科技廳省級條件建設與民生科技專項基金（BM2013058）

210002江蘇南京，南京軍區南京總醫院，1．婦產科，2．全軍檢驗醫學研究所

吳元赭，E?mail∶Wuzhe860103＠sina．com

（本文編輯∶齊 名； 英文編輯∶王建東）