糖皮質激素受體基因多態性與膿毒癥臨床轉歸的相關性研究

劉 瑜，方 放，黃 方

·論 著·

糖皮質激素受體基因多態性與膿毒癥臨床轉歸的相關性研究

劉 瑜，方 放，黃 方

目的 探討華東漢族人群糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）基因多態性與膿毒癥臨床轉歸的相關性。方法 共募集膿毒癥患者194例。以連接酶檢測反應（ligase detection reaction，LDR）技術對GR基因中的15個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點進行基因分型。非條件Logistic回歸，校正年齡、性別、吸煙、飲酒、APACHEⅡ評分后，在不同遺傳模式下分析各基因型與膿毒癥臨床轉歸（器官功能障礙、休克、死亡）的相關性。結果 rs9324924 GT／TT攜帶者與GG攜帶者相比較，可能降低重度器官功能障礙風險（OR［95%CI］＝0．39［0．16～0．99］，P＝0．047）；rs4912905 CG／CC攜帶者與GG攜帶者相比較，發生重度器官功能障礙風險增加（OR［95%CI］＝2．53（0．99～6．50），P＝0．047）；rs9324921 CA／AA攜帶者與發生膿毒性休克的風險是CC攜帶者的2．47倍（OR［95%CI］＝2．47（1．04～5．84），P＝0．038）。未發現與膿毒癥死亡相關的位點。結論 GR基因單核苷酸多態性可能與華東漢族人群膿毒癥后器官功能障礙和休克發生相關。

膿毒癥；糖皮質激素受體；單核苷酸多態性；臨床轉歸

膿毒癥為感染引起的全身炎癥反應綜合征，其發病機制目前尚未闡明。已有研究表明，遺傳因素在膿毒癥及其他多種疾病的發生及多樣化的臨床轉歸中發揮重要作用［1?3］。了解膿毒癥發生的遺傳因素，有助于對危重患者早期診斷并施行個體化治療，提高膿毒癥患者存活率。糖皮質激素受體（GR）屬于核受體超家族成員，其本質是配體調控的核轉錄因子。GR與糖皮質激素（glucocorticoid，GC）結合后，通過多種機制抑制炎性細胞因子的轉錄和表達，從而調節炎癥反應過程［4?7］。GR遺傳變異可能影響GR的功能，影響其對炎癥反應的調節能力。攜帶相關變異型的患者易產生過度炎癥反應，表現為對膿毒癥易感或預后不良。本研究以GR基因為候選基因，分析中國華東漢族人群中GR基因單核苷酸多態性（nucleotide polymorphism，SNP）與膿毒癥臨床轉歸的相關性，為危重膿毒癥患者早期診療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 自2014年2月－2015年2月，連續收集南京軍區南京總醫院呼吸科收治的由肺部感染導致的膿毒癥患者194例。診斷標準參照2001年美國胸科醫師學會和危重病醫學會制定的膿毒癥診斷和分級標準。患者的入選標準為∶①年齡≥14周歲；②漢族，籍貫為中國華東地區（江蘇、浙江、安徽、上海），相互間無生物學親緣關系；③膿毒癥診斷明確，且原發感染灶為肺部；④病史資料和臨床實驗室檢查和輔助檢查結果齊全。排除標準∶①入院后24 h內死亡；②具有其他特殊疾病，如獲得性免疫缺陷綜合征、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、器官移植后等；③曾攝入或應用過對炎癥過程有調節作用的細胞因子，如TNF?α抗體、INF?γ等；④接受免疫抑制劑和激素治療；⑤孕婦。采用調查表收集患者的社會人口學資料、既往史、吸煙、飲酒史、實驗室檢查和輔助檢查資料及膿毒癥診斷基本指標、診斷膿毒癥后24 h內急性生理和慢性健康評分系統（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ）評分，住院期間多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）最高評分（參照Marshall MODS評分系統）、臨床轉歸（器官功能障礙、休克、死亡）。所有入選病例抽取靜脈血3 mL，枸櫞酸鈉抗凝，－80℃保存備用。所有受試者均簽署知情同意書。本研究經南京軍區南京總醫院倫理委員會的審核通過。

1.2 方法

1.2.1 SNP位點的選擇 在Pubmed（http∶／／www．ncbi．nlm．nih．gov／pubmed／）上查閱已發表的有關GR基因多態性與疾病相關性研究的文獻，找到常見的SNP位點。查閱NCBI的dbSNP數據庫（http∶／／www．ncbi．nlm．nih．gov／snp），找到位于基因功能區（外顯子、3′及5′非翻譯區）的SNP位點。從HapMap數據庫（http∶／／www．hapmap．org）中選擇北京漢族人群樣本，以r2＞0．8，作為條件，得到標簽SNP（Tag SNP）。以上得到的SNP位點且在中國人群中次要等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）大于10%者為入選，最終選取15個SNP進行研究（表1）。

1.2.2 基因分型 采用德國QIAGENTM試劑盒提取外周靜脈血DNA。基因分型采用上海天昊生物科技有限公司改良的連接酶檢測反應（LDR）分型方法。根據dbSNP數據庫提供的基因組序列自行設計引物。PCR過程中設置陰性對照。實驗結束后隨機雙盲選取20個標本進行重復性檢驗，重復率達100%。

1.3 統計學處理 使用SPSS軟件（19．0版本，SPSS Inc．，Chicago，IL，USA）進行統計學分析。計數每個SNP位點的基因型頻率，進行goodness?of?fit χ2檢驗，判斷是否符合Hardy?Weinberg平衡。連續變量的差異采用獨立樣本的t檢驗，分類變量采用χ2檢驗。根據臨床轉歸將膿毒癥病例進行分組∶①輕度器官功能障礙（MODS評分0～8分）和重度器官功能障礙組（MODS評分9～18分）；②膿毒癥休克和非休克組；③死亡和存活組。采用非條件Logistic回歸模型校正年齡、性別、體重指數（body mass index，BMI）、吸煙、飲酒、慢性病狀態、APACHEⅡ評分等，在不同的遺傳模式下分析各位點基因型頻率與膿毒癥臨床轉歸的關系，計算P值、比值比（odds ratio，OR）和95%置信區間（confidential inter?val，CI）。所有統計均為雙側檢驗，P＜0．05為差異具有統計學意義。

表1 糖皮質激素受體基因SNP位點信息

2 結 果

2.1 研究對象 共納入194名膿毒癥患者（表2），原發感染灶均為肺部，年齡16～95（61．90±18．47）歲，男性比例較高（63．92%）。痰培養以革蘭陰性菌（28．87%）和混合性感染（29．90%）多見，最常見的感染細菌為銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌。革蘭陽性菌感染（4．12%）中最常見的為金黃色葡糖球菌。單純真菌感染12例（6．19%），其中曲霉菌感染4例。住院期間并發重度器官功能障礙41例（21．13%）、膿毒性休克51例（26．29%），死亡57例（29．38%）。每兩組之間的社會人口學資料和臨床特征比較見表3～5。

2.2 GR基因多態性與膿毒癥臨床轉歸的相關性 除rs4607376外，其他位點的頻率分布在本組病例中均符合Hardy?Weinberg平衡。rs6198在本研究膿毒癥病例中未檢測出突變型，故rs4607376和rs6198兩個位點未納入統計分析。校正年齡、性別、吸煙、飲酒、APACHE II評分后，非條件Logistic回歸分析顯示，rs9324924與膿毒癥器官功能障礙相關，GT／TT基因型較GG能夠降低重度器官功能障礙風險（OR［95%CI］＝0．39［0．16～0．99］，P＝0．047）；rs4912905 CG／CC基因型較GG發生重度器官功能障礙風險增加1．53倍（OR［95%CI］＝2．53（0．99～6．50），P＝0．047）（表6）。rs9324921 CA／AA基因型發生膿毒性休克的風險是CC的2．47倍（OR［95%CI］＝2．47（1．04～5．84），P＝0．038）（表7）。在本研究中，未發現位點與膿毒癥死亡有關。

表2 膿毒癥患者臨床特征

表3 輕度和重度器官功能障礙患者臨床特征比較

表4 休克與非休克患者臨床特征比較

表5 存活與死亡患者臨床特征比較

表6 糖皮質激素受體基因多態性與膿毒癥器官功能障礙的相關性［n（%）］

表7 糖皮質激素受體基因多態性與膿毒性休克的相關性［n（%）］

3 討 論

GR基因位于人染色體5q31?q32，含有9個外顯子。根據對第9個外顯子mRNA剪切方式的不同，產生α、β兩種異構體，GC的抗炎作用主要是通過GR?α介導的。當GC與GR結合后發生同源二聚化，在細胞核內通過多種機制抑制炎性細胞因子的轉錄和表達（如TNF?α、IL?1等）［4?7］，即GR基因是調控炎性細胞因子生成的上游基因。GR基因突變或多態性可影響GR功能，導致個體間炎癥反應的差異和對GC治療的敏感性。因此，GR基因是膿毒癥遺傳學因素研究的候選基因。既往GR基因多態性與肥胖、高血壓病、血脂紊亂、支氣管哮喘、慢性支氣管炎、特發性關節炎等的關系已有報道，但與膿毒癥的相關性尚未見報道［8?10］。本研究首次研究了中國華東漢族人群中GR基因多態性與膿毒癥臨床轉歸的相關性。

研究報道最多的與感染或炎癥相關的GR基因SNP位點位于外顯子9 β3'UTR區的rs6198（G＜A）。該位點GG基因型在荷蘭人群能夠降低鼻腔內金黃色葡糖球菌定植風險［11］，與白種人類風濕性關節炎發病相關［12］，能增加白種人老年人群IL?6和超敏CRP水平［13］。在本研究膿毒癥病例中未檢測到rs6198突變型，與有關中國漢族急性淋巴細胞白血病兒童的檢測結果一致，考慮該位點在中國漢族人群中的突變頻率遠較白種人低，故該位點無法進行關聯分析，有待于進一步擴大樣本量進行研究。Panek等［14］報道rs10052957與喘息型慢性支氣管炎發病有關，Kostik等［15］發現rs41423247與白種人女孩幼年特發性關節炎發病年齡和炎癥反應水平有關，而在本研究中這兩個位點與膿毒癥臨床轉歸均無相關。考慮原因是由于選擇壓力的存在，不同人群基因SNP存在較大差異，同時由于入選病例數量、感染病原體的差異和不同環境因素的作用，導致有些位點在其他人群報道中與感染或炎癥有關，而在本研究人群中為陰性結果。

因膿毒癥的發生與多種遺傳因素有關，可能涉及多個基因變異，因此我們未采取既往研究只選擇位于編碼區或啟動子區的1個或幾個SNP進行研究，而是綜合3種方法選擇更廣范圍的SNP位點（15個），最大程度的代表了GR基因上常見遺傳信息。這些位點中的大多數在既往關聯研究中都未見報道。結果表明，rs9324924 GT／TT基因型較GG型能夠降低重度器官功能障礙風險；rs4912905 CG／CC基因型較GG型發生重度器官功能障礙風險增加；rs9324921 CA／AA基因型發生膿毒性休克的風險比CC型高，提示GR基因變異與膿毒癥相關，有關基因型可能成為膿毒癥臨床轉歸的預警指標。3個陽性位點均位于內含子中（見表1），研究表明內含子區突變可能通過影響mRNA的剪切、穩定性或定位來影響基因的功能［16］。但不排除這些陽性位點因和其他與膿毒癥有關的SNP位點連鎖，而表現出與膿毒癥相關。因此對于本研究得到的陽性位點還要擴大樣本量進行驗證，以了解其具體機制。

總之，GR基因多態性可能與膿毒癥臨床轉歸相關。深入了解GR基因多態性影響膿毒癥的機制，不僅有助于進一步理解膿毒癥的發病機制，還可以根據患者的基因型，對高危患者進行早期、個體化治療，以期研制出療效更好、副作用更小的GR激活劑，為膿毒癥治療提供新的思路。

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（收稿日期∶2015?07?15；修回日期∶2015?08?23）

（本文編輯∶齊 名； 英文編輯∶王建東）

Association of polymorphisms in glucocorticoid receptor with outcome of sepsis in a Chinese Han population

LIU Yu，FANG Fang，HUANG Fang． Department of Geriatrics，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Geriatric Research Center of Nanjing Military Command，Nanjing，Jiangsu 210002，China

Objective To explore the association of glucocorticoid receptor（GR）gene polymorphisms with outcome of sepsis in Eastern China population．Methods Total of 15 single nucleotide polymorphisms（SNPs）were classified by genotype in 194 septic patients using LDR technology．Unconditioned logistic regression analysis was used to explore the association of GR gene polymorphisms with outcome（organ dysfunction／shock／death）of sepsis after adjusting for age，sex，smoking and drinking status and APACHEⅡscore．Results Compared with GG genotype，the rs9324924GT／TT reduced severity of organ dysfunction with OR value of 0．39（95% CI∶0．16－0．99，P＝0．047）．The rs4912905 CG／CC genotype increased the risk of severe organ dysfunction compare with GG genotype（OR［95%CI］＝2．47［1．04－5．84］，P＝0．038）．The CA／AA genotype of rs9324921 polymorphism were significantly overrepresented among septic shock patients compared with controls（OR［95%CI］＝2．47［1．04－5．84］，P＝0．038）．However，there were no associa?tions between polymorphisms of GR gene and death of sepsis．Conclusion Genetic polymorphisms in GR gene are thought to associate with severity of organ failure and shock after sepsis．

sepsis；glucocorticoid receptor；single nucleotide polymorphism；clinical outcome

R631．2

A

10．3969／j．issn．1672?271X．2015．06．005

∶2015?07?20；

∶2015?09?17）

南京軍區南京總醫院院管課題（2014068）

210002江蘇南京，南京軍區南京總醫院干部二科，南京軍區老年病研究中心

黃 方，E?mail∶88100224＠qq．com