肝素粗品提取新工藝研究

楊濤，萬端極，*，吳正奇，鄒華榮，馬超

（1.湖北工業大學資源與環境工程學院，湖北武漢430068；2.湖北工業大學食品與制藥工程學院，湖北武漢430068）

肝素粗品提取新工藝研究

楊濤1，萬端極1，*，吳正奇2，鄒華榮1，馬超1

（1.湖北工業大學資源與環境工程學院，湖北武漢430068；2.湖北工業大學食品與制藥工程學院，湖北武漢430068）

以豬小腸黏膜酶解液為原料，通過酸堿與沉淀劑A對原料除雜，然后直接醇沉肝素粗品。原料以除雜率和總效價為指標，優化出堿除雜的pH為11.0、酸除雜的pH為3.0；以除雜率為指標，并采用響應面法優化沉淀劑A的沉淀條件：沉淀劑A的用量為0.34%、pH為7.3和溫度為30.0℃。再用乙醇沉淀，干燥后得到效價為106 U/mg的肝素粗品。與傳統工藝相比，肝素粗品的純度至少提高5.66%，肝素損失率從22.15%降至14.60%。

肝素；效價；除雜

肝素是一種廣泛存在于動物各組織內的黏多糖，為白色或類白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機溶劑，由D-葡糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺及D-葡糖醛酸交替組成的黏多糖硫酸酯，分子量分布在6 000～20 000 Da，是一種天然抗凝血物質，被廣泛用于治療血栓塞、暴發性流腦、急性心肌梗塞、動脈硬化等疾病，還具有澄清血漿脂質，降低膽固醇等作用[1-3]。

目前國內提取肝素的工藝較多，主要以離子交換為主，該工藝繁瑣，耗時長，肝素損失率高[4]。本文在豬小腸黏膜充分酶解的基礎上，通過強化前期除雜，對除雜液直接乙醇沉淀肝素粗品，簡便工藝，降低生產成本，降低肝素損失率。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

新鮮豬小腸粘膜由武漢市肉聯廠購得；復合蛋白酶（0.56 mka/g）：北京普諾信達科技有限公司；肝素鈉標準品（198 U/mg）：中國藥品生物制品鑒定所；綿羊血漿：山東蒼山向明生化助劑廠；沉淀劑A：湖北工業大學膜技術研究所；鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、95%乙醇：均為AR；HH-2數顯恒溫水浴鍋：上海嘉程儀器設備廠；DZX-6000B真空干燥箱：上海福瑪實驗設備有限公司；JJ-1增力電動攪拌器：上海賽康科技電器有限公司；PHS-4pH酸度計：上海偉業儀器廠；WFZ800-D3B型可見紫外分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；RE-52冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.2 檢測與評定方法

1.2.1 肝素效價測定

綿羊血漿法[5]，計量單位用美國藥典單位（USP）表示[6]。

1.2.2 總氮含量測定

微量凱氏定氮法。

1.2.3 P含量測定

微量定磷法[7]。

1.2.4 除雜效果評定，采用除雜率為指標：

式中：P1為除雜前的磷含量，（mg/mL）；P2為除雜后的磷含量，（mg/mL）；N1為除雜前的氮含量，%；N2為除雜后的氮含量，%。

1.3 肝素提取工藝流程

豬小腸黏膜酶解液[8]→堿除雜→酸除雜→沉淀劑A除雜→乙醇沉淀→干燥→肝素粗品

1.4 豬小腸黏膜酶解液純化工藝研究

1.4.1 堿除雜pH的選擇

準確量取6份豬小腸黏膜酶解液各100 mL，分別調pH為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5，置于5℃的環境中，60 r/min攪拌20 min，低溫離心，4 000 r/min離心20 min，取上清液檢測。以每份上清液總效價和除雜率為指標，記錄實驗數據。分析不同pH對肝素總效價和除雜率的影響，確定堿除雜的最適pH。

1.4.2 酸除雜pH的選擇

準確量取6份1.4.1處理液各100 mL，分別調pH為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，置于5℃的環境中，60 r/min攪拌20 min，低溫離心，4 000 r/min離心20 min，取上清液檢測。以每份上清液總效價和除雜率為指標，記錄實驗數據。分析不同pH對肝素總效價和除雜率的影響，確定酸除雜的最適pH。

1.4.3 響應面法優化沉淀劑A除雜條件

采用中心組合實驗Box-Behnken設計方案，分別用A、B、C來表示沉淀劑的用量（%）、反應pH、反應溫度（℃），并以+1、0、-1分別代表變量水平，實驗因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 堿除雜pH對除雜率與總效價的影響

堿除雜pH對除雜率與總效價的影響見圖1。

圖1 堿除雜pH對除雜率與總效價的影響Fig.1 Alkali removing impurity of pH for removing impurity effect and the influence of heparin activity

圖1表明，隨著pH的升高，除雜率呈增加趨勢，肝素的總效價呈下降趨勢。由于小腸粘膜酶解后還會存在一些蛋白，當pH調至相應等電點時，可除去部分含N物質；過高的pH會使肝素的一些化學鍵破壞，使肝素的活性降低。從圖1可以看出當pH大于11.0時，除雜率趨于穩定，同時總效價持續下降，由此可以確定堿除雜的最適pH為11.0。

2.2 酸除雜pH對除雜率與總效價的影響

酸除雜pH對除雜率與總效價的影響見圖2。

圖2 酸除雜pH對除雜率與總效價的影響Fig.2 Acid removing impurity of pH for removing impurity effect and the influence of heparin activity

圖2表明，隨著pH的升高，除雜率呈下降的趨勢，肝素的總效價呈上升降趨勢。部分含N物質在酸性環境下被除去；部分含P物質也會在低pH下沉淀。過低的pH會使肝素的氮硫酸基破壞，使肝素的活性降低。從圖2可以看出當pH小于3.0時，除雜率穩定上升，總效價迅速降低，由此可以確定酸除雜的最適pH為3.0。

2.3 沉淀劑A除雜條件的響應面法優化

2.3.1 模型的建立與顯著性檢驗

利用Design-expert軟件對試驗數據進行多元回歸擬合。可得到雜質去除率（Y）對沉淀劑用量（A）、pH（B）與溫度（C）的二元多次回歸模型為：

Y=9.67+0.51A-0.17B+0.027C-0.5AB-0.085AC+ 0.7BC-1.18A2-0.76B2-0.2C2

回歸模型的方差分析結果見表2。

表2 回歸模型的方差分析結果Table 2Analysis of variance for fitted quadratic polynomial model

從表2中可以看出失擬項不顯著（p=0.122 7> 0.05），而模型的p值<0.01，表明模型極顯著；同時軟件分析的復相關系數R2=0.971 2，校正后的R2Adj=0.934 1，這表明該模型的擬合程度良好，試驗誤差小，故可以用此模型來分析和預測沉淀劑A除雜率。

2.3.2 響應面優化

根據回歸線方程，作出響應面，考察擬合響應曲面的形狀，以雜質的去除率最大為指標進行優化，分析沉淀劑用量、pH和溫度對除雜率的影響。響應面的形狀如圖3～圖5所示。

圖3 沉淀劑用量與pH的響應曲面Fig.3 Response surface of Y=（A，B）

通過Design-expert軟件分析，得到沉淀劑A除雜的最優工藝條件為：沉淀劑A的用量為0.34%，pH為7.3與溫度為30.0℃，在此條件下，除雜率預測值為9.87%。進行3次驗證性實驗，結果除雜率分別為9.80%，9.78%與9.95%，平均值為9.84%，比預測理論值低0.03%。因此，響應面法所得到的優化工藝條件準確可靠，具有實用價值。

圖4 沉淀劑用量與溫度的響應曲面Fig.4 Response surface of Y=（A，C）

圖5 pH與溫度的響應曲面Fig.5 Response surface of Y=（B，C）

2.4 工藝結果分析

傳統的作坊式生產的肝素粗品效價基本在80U/mg～100 U/mg；肝素損失率在22.15%左右。采用本工藝處理，干燥后的產品效價可達106 U/mg，其純度至少提高5.66%；工藝過程中肝素損失率降至14.60%左右。

3 結論

本工藝在對原料純化時，以肝素總效價和除雜率為指標，通過實驗優化得：堿除雜的最適pH為11.0；酸除雜的最適pH為3.0。以除雜率為指標，通過響應面法優化得到沉淀劑A除雜的最優條件：沉淀劑A的用量為0.34%、pH為7.3和溫度為30.0℃。經除雜后的液體采用乙醇直接沉淀，干燥后可得到106 U/mg的肝素粗品，其純度至少提高5.66%，肝素損失率從22.15%降至14.60%。本工藝除雜后的溶液為澄清透明，具有較好的流動性，為后續分離純化工藝提供了更多選擇；同時本工藝還可以對除雜沉淀物與沉淀肝素后的溶液進行聯產蛋白與多肽等產品，增加附加值。與傳統工藝相比，本工藝具有：肝素損失率低、工藝簡便和生產成本低等優點。

[1]李家增.抗凝血藥的應用[J].中華醫學雜志,2004,84(8):12-13

[2]陳自然.從豬小腸黏膜中提取肝素鈉的生產技術改進[J].川北教育學院學報,2001,11(1):55-57

[3]Weitz J,Hirsh J.New anticoagulant strategies[J].J Lab Clin Med, 1993,122(4):364-373

[4]王國棟,楊佳藝,楊佳,等.肝素提取純化技術研究進展[J].食品工業科技,2012,33(9):436-440

[5]謝金明.肝素鈉生物效價測定中血漿固度形態判定方法介紹[J].中國生化藥物雜志,1992,13(2):65-67

[6]USPInc.US pharmacopeia National Formulary XXⅢ[M].Rockville, MD,Published by USPInc,2011:776-778

[7]陳慶森,龐光昌,吳子健.實用生物化學實驗技術指導[M].天津:天津科學技術出版社,2006:83-85

[8]海文英.酶法結合膜技術制備高效價肝素鈉的工藝研究[J].科學技術與工程,2013,13(11):165-168

Research on the New Method of Extraction Crude Heparin

YANG Tao1，WAN Duan-ji1，*，WU Zheng-qi2，ZOU Hua-rong1，MA Chao1
（1.Hubei University of Technology School of Resources and Environmental Engineering，Wuhan 430068，Hubei，China；2.Hubei University of Technology School of Food and Pharmaceutical Engineering，Wuhan 430068，Hubei，China）

This study explored a new method.Adopting different pH and using precipitant A to remove the impurities.Then，crude heparin was precipitated by ethanol.Porcine intestinal mucosa hydrolyzate as feedstock，regard the rate of removed impurities and the total of titer as an indicator，optimization of the alkaline pH of 11.0，acid pH of 3.0.Regard the rate of removed impurities as an indicator，using response surface methodology to optimize the precipitation conditions.Determining precipitation reaction conditions are that precipitant agent A dosage 0.34%，pH7.3 and the temperature 30.0℃.The dry of crude heparin is 106U/mg.In the course of preparation of heparin，The purity of crude heparin enhanced at least 5.66%，the rate of loss dropped 22.15%to 14.60%.

heparin；titer；remove impurities

2013-09-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.012

貴州省科技計劃項目（黔科合SY字[2013]3014]）

*通信作者