玉米糖渣成分分析及酶解法提取蛋白的工藝優化

左瑩，張萍，曹雪丹，張惠，張新華

（1.寧夏職業技術學院生物與制藥技術系，寧夏銀川750021；2.浙江省農業科學院柑橘研究所，浙江臺州318020；3.新疆阿克蘇地區農業技術推廣中心，新疆阿克蘇843000）

玉米糖渣成分分析及酶解法提取蛋白的工藝優化

左瑩1，張萍1，曹雪丹2，張惠1，張新華3

（1.寧夏職業技術學院生物與制藥技術系，寧夏銀川750021；2.浙江省農業科學院柑橘研究所，浙江臺州318020；3.新疆阿克蘇地區農業技術推廣中心，新疆阿克蘇843000）

以玉米淀粉糖渣為研究對象，采用酶法水解糖渣中的蛋白，并優化酶催化法提取蛋白的工藝條件，結果表明：糖渣中蛋白含量最高33.1 g/100 g，尤其是谷氨酸、亮氨酸等呈味氨基酸含量較高，符合開發成為調味品或食品添加劑的基本要求；通過不同酶品種水解糖渣進行蛋白提取，結果表明，堿性蛋白酶提取率最高29.02%；采用單因素結果分析結合正交實驗優化糖渣中蛋白分離工藝，結果為提取溫度45℃，pH11.5，加酶量1%，料液比1∶11（體積比），提取時間為3 h時提取率可達39.77%；對所提蛋白中氨基酸組分分析可知谷氨酸、亮氨酸含量較糖渣中含量增加最多，分別可達8.332和6.089，具有開發利用的價值和潛力。

玉米淀粉糖渣；酶法；提取蛋白

玉米淀粉糖渣是玉米淀粉在制糖工業或發酵企業制糖工段經雙酶法制糖后過濾糖液得到的濾渣，產量很大，具不無完全統計每年僅發酵企業就產生高達1 500 t玉米淀粉糖渣。隨著以玉米淀粉為原料的發酵及制糖企業生產規模的不斷擴大，糖渣副產物亦隨之增多，使企業的環保壓力越來越大；若簡單熱風干燥以飼料出售，能耗高、產品附加值低。然而對玉米淀粉糖渣理化分析發現其蛋白含量較豐富，達到30%以上。且有文獻報道，來源于玉米淀粉糖渣的蛋白更是不含重金屬等毒性物質、富含脂類、糖類等成分，含有大量呈味氨基酸、具有良好的消化性和高營養價值。具有開發成調味品、食品添加劑、功能性蛋白質粉、膳食蛋白添加劑的潛力[1-2]。本課題擬采用酶法催化玉米淀粉糖渣水解，確定最適酶的品種，并優化催化玉米淀粉糖渣中蛋白分離的催化條件，以提高蛋白提取率，并對分離蛋白中氨基酸成分進行分析，功能特性進行評定，將為探索玉米淀粉糖渣的深加工、解決企業廢料環境污染問題，延長產業鏈等提供前期試驗數據與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉制糖后糖渣：伊品生物技術有限公司；酸性蛋白酶（30 000 U/g）、中性蛋白酶（30 000 U/g）、堿性蛋白酶（100 000 U/g）：夏盛實業有限公司；Folin-酚法所用試劑、苯酚硫酸法等所用試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

HH—2數顯電熱恒溫水浴鍋-雙孔：杭州拓興實驗儀器廠；DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；雷磁PHS-2酸度計：上海精科儀器廠；MGLG20-W臺式高速離心機：北京中西遠大科技有限公司；RT-12高速粉碎機：北京普諾眾達科技有限公司；752Pro紫外可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀：日立高新技術公司；E02140型電子分析天平：梅特勒—托利多儀器上海有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 感官及理化成份分析

粗蛋白含量的測定按GB/T5009.5-2010《食品中粗蛋白含量的測定》[3]；粗脂肪含量的測定按索氏抽提法GB/T14772-2008《食品中粗脂肪含量的測定》[4]；水分含量的測定按直接干燥法GB/T5009.3-2010《食品中水分的測定》[5]；灰分含量的測定按直接灰化法GB/ T5009.4-2010《食品中灰分的測定》[6]。

1.3.2 蛋白提取工藝

參考陳中愛[2]的方法，準確稱量15.0 g糖渣，加去離子水適量，調節pH，加酶液，在既定的溫度下攪拌進行反應，水解完畢后在80℃下滅酶15 min，然后離心分離，取上清液測定蛋白質含量。

1.3.3 酶品種篩選試驗

參考陳中愛[2]的方法，以提取率為指標進行篩選，從酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶3種酶中選出提取蛋白效果最好的一種，這3種酶均在各自的最適條件對糖渣進行水解。

1.4 單因素對酶催化蛋白質提取工藝優化

有文獻[2]顯示，加酶催化時的溫度、pH、加酶量、提取時間和料液比（體積比）等催化條件都會對催化效果產生顯著影響，參考陳中愛[2]等的方法，對堿性蛋白酶進行以上因素的單因素試驗，確定單因素試驗的最優催化條件。

1.5 正交試驗優化蛋白酶催化條件

在單因素試驗結果的基礎上，以蛋白質提取率為主要參考指標，設計五因素四水平的試驗如表1。

表1 蛋白酶催化條件正交試驗因素水平設計Table 1Orthogonal factor level design of protease catalyticconditions

擬確定各因素對蛋白提取率的顯著性，并在此基礎上確定各因素的最佳組合條件。試驗結果數據采用SPSS軟件進行分析。

1.6 酶處理前后氨基酸組分分析

對于玉米淀粉糖渣干粉與經酶處理后的玉米淀粉糖渣中氨基酸的組分采用氨基酸分析儀測定氨基酸含量[7]，并對酶處理前后各氨基酸組分變化進行比對分析。

1.7 蛋白含量的測定

參考陳中愛[2]的方法，采用Folin-酚法測定提取液中的蛋白質含量，以牛血清白蛋白做標準曲線。蛋白質固體：采用凱氏定氮法。

1.8 蛋白提取率計算

粗蛋白提取率（%）=提取蛋白粗品的克數/干渣樣品中蛋白的克數×100

2 結果與分析

2.1 感官與理化分析

玉米制糖脫糖后糖渣感官分析結果如表2，濕渣呈淡黃色團塊狀氣味微酸，干渣顏色略深（分析與熱干燥有關），呈棕黃色，無明顯氣味。對糖渣的理化成分結果如表3，渣中蛋白含量33.1 g/100 g（占干物質33.1%），此外還有23.7%的糖類物質和少量的脂肪（9.74 g/100 g）、灰分（4.79 g/100 g）等。糖渣中蛋白質含量較高，有文獻顯示其中的重金屬含量也遠在國家食品標準的限度以下[8]，具有開發成為食品添加劑或功能性食品的前提條件。

表2 玉米淀粉糖渣感官分析Table 2Sensory analysis of corn starch sugar residue

表3 玉米淀粉糖渣理化指標檢測Table 3Physical and chemical indicators to detect of corn starch sugar residueg/100 g

2.2 酶品種的篩選

酶品種的篩選見表4。

表4 催化玉米淀粉糖渣蛋白質水解的酶品種的篩選Table 4Catalyze the hydrolysis of corn starch sugar residueprotein enzyme screening varieties

本試驗中選選取中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶3種酶對粉碎后的玉米淀粉干渣進行蛋白的酶解催化提取。由于不同種類的蛋白酶的作用于蛋白質的機理和酶催化動力學特征不同導致提取效果有明顯不同。由表4結果可知，堿性蛋白酶的提取效果在所選3種酶制劑中最好，提取率達33.14%，有文獻顯示糖渣蛋白主要是堿溶性的谷蛋白，稀堿可以使渣中淀粉結構變得松散，對蛋白質和淀粉的分離起到了促進作用[9]，同時堿性蛋白酶是一種內切肽酶，能夠水解多種蛋白，提取率相對較高，且售價合理。所以，本試驗采用堿性蛋白酶。

2.3 單因素試驗

2.3.1 溫度對蛋白質提取率的影響

在料液比1∶9、提取時間4 h、酶量1.00%、pH 11的條件下，分別選取35、40、45、50、55、60℃作為試驗溫度，測定蛋白提取率，結果如圖1

圖1 溫度對蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of temperature on the extraction rate of protein

由圖1可知，在溫度為45℃下，蛋白質提取率最高，當溫度超過45℃時，隨著溫度的升高提取率有所下降，原因可能是溫度過高，酶蛋白質在長時間受熱的影響下空間結構發生變化，尤其是具有催化活性的四級結構發生變化，易變性，同時由于疏水基團的暴露和展開、蛋白質分子的聚集，使糖渣中的蛋白質溶解度下降，導致酶提時蛋白質提取率下降[2]。

2.3.2 加酶量對蛋白質提取率的影響

在料液比1∶9、提取時間4 h、提取溫度45℃、pH11的條件下，分別選取酶量0.2%、0.5%、0.8%、1.0%、2.0%、4.0%作為試驗條件，測定蛋白提取率。如圖2所示。

圖2 加酶量對蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on the extraction rate of protein

在加酶量為0.20%～1.00%的范圍內，蛋白提取率隨著酶用量的增加而增大。當酶的添加量為1.00%時，蛋白提取率最高，繼續增大酶量，提取率下降。隨著酶用量的繼續增加，糖渣蛋白的得率逐漸減少，可能是剛開始加入酶的時候，底物與酶的活性部位迅速結合轉變成產物，隨著反應的進行底物已飽和，酶濃度過高會使部分蛋白質水解，綜合提蛋白效果和經濟成本，酶量確定為1.00%。

2.3.3 pH對蛋白質提取率的影響

在提取時間4 h、提取溫度45℃、酶量1.00%、料液比1∶9條件下，分別選取pH為9、9.5、10、10.5、11、11.5、12作為試驗條件，測定蛋白提取率。糖渣蛋白80%以上是堿溶性谷蛋白，因此選擇的試驗pH條件都是在堿性條件下。從圖3可以看出隨著pH的增大，提取率呈增大的趨勢，pH為11.0時，糖渣蛋白提取率達到33.17%。

圖3 pH對蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of pH value on the extraction rate of protein

一般情況下，蛋白在胚乳中與淀粉結合較緊密，難以溶出，堿性環境能使它們的緊密結構變得疏松，促使蛋白與淀粉的分離。但是當pH過高，如增加到11以上時，大米蛋白的提取率反而有些下降，這是由于淀粉在堿性條件下糊化后黏度增大，阻礙了蛋白質的溶出[10]。因此確定提取糖渣蛋白的pH為11.0。

2.3.4 糖渣料液比對蛋白質提取率的影響

在提取時間4 h、提取溫度45℃、酶量1.00%、pH為11條件下，分別選取料液比為1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15作為試驗條件，測定蛋白提取率，結果見圖4。

圖4 糖渣料液比對蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of sugar residue liquid ratio on the extraction rate of protein

從圖4可以看出隨著料液比比例的減少，提取率呈增大的趨勢，當達到1∶11時達到最高，糖渣蛋白提取率達到28.8%，之后進一步減小料液比，提取率略有下降，綜合考慮提取率和節能減排等因素，確定料液比1∶11為最適料液比。

2.3.5 催化時間對蛋白提取率的影響

在提取溫度45℃、酶量1.00%、料液比1∶9、pH 11的條件下，分別選取時間為1、2、3、4、5、6h作為試驗條件，測定蛋白提取率。結果見圖5。

圖5 催化時間對蛋白提取率的影響Fig.5

由圖5可知，在提取初期，蛋白質提取率隨著提取時間的延長而升高，提取時間在4 h時提取率最大；之后，提取率逐漸下降。這可能與部分溶出蛋白質可與殘留淀粉重新結合，使提取率下降有關，也有文獻顯示蛋白酶催化玉米蛋白質水解時或作用于氨基肽鍵，或作用于羧基肽鍵，也會分解掉部分氨基酸導致其提取率下降[9]。因此確定最佳提取時間t為4 h。

2.4 正交試驗結果與分析

正交試驗結果與分析如表5，方差分析如表6。

表5 蛋白酶催化條件正交試驗結果與直觀分析Table 5Results of orthogonal test of catalytic conditions ofprotease and visual analysis

表6 蛋白酶催化條件正交試驗方差分析Table 6Analysis of variance of orthogonal test of protease catalytic conditions

由表5和表6可知，影響蛋白酶催化條件的主次因素依次為pH（A）＞加酶量（B）＞料液比（E）＞提取時間（D）＞提取溫度（C），對各因素不同水平均值進行比較，以A4B2C2D1E3組合為最佳條件，即在pH11.5，加酶量1.0，料液比1∶11，提取時間3小時和提取溫度45℃條件下為正交分析最優化條件，與單因素試驗結果基本一致。其中pH、加酶量、料液比對提取率有顯著影響（a=0.05）。

2.5 驗證試驗

通過對正交結果的試驗條件進行驗證，即在在pH11.5，加酶量1.0，料液比1∶11，提取時間3小時和提取溫度45℃條件下再次提取玉米淀粉糖渣中的蛋白，蛋白提取率達33.77%。

2.6 酶解法處理前后氨基酸組分分析

采用氨基酸分析儀分別測定糖渣和經堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶分別催化后的樣品中氨基酸組分的含量，結果如表7所示，堿性蛋白酶處理樣品中氨基酸組分的增長量最大，總氨酸達42.045 4，其次是中性蛋白酶處理的樣品，而酸性蛋白酶的結果有所減少，分析原因，可能與玉米蛋白中的氨基酸多為

堿溶性蛋白有關，且其中的谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸的增幅最大，谷氨酸是提鮮的呈味氨基酸，天冬氨酸具有保護心肌和降低血壓的醫療作用，而亮氨酸也是常用的營養增補劑和增味劑[11]，在食品行業中有廣泛的用途，具有進一步加工成食品調味劑和功能性食品的潛力。

表7 不同酶品種催化玉米淀粉糖渣水解后氨基酸成分分析Table 7Analysis of amino acid composition in different enzymes catalyze the hydrolysis of corn starch sugar residue

3 結論與討論

1）玉米淀粉糖渣中富含蛋白質、糖類和脂類物質，且重金屬含量低于食品限量，具備開發為功能性蛋白粉、呈味劑或提鮮劑等食品添加劑的前提條件。

2）經單因素優化試驗表明，采用45℃、1%加酶量、pH11和料液比1∶11體積比的提取條件，蛋白質提取率最高。在此基礎上，進行正交試驗，其結果表明各因素對糖渣蛋白提取率影響程度依次為：pH（A）＞加酶量（B）＞料液比（E）＞提取時間（D）＞提取溫度（C），因此確定最佳提取工藝條件為pH11.5，加酶量1.0%，料液比1∶11，提取時間3小時和提取溫度45℃，經正交試驗結果驗證在最佳工藝條件時的提取率為33.77%。

3）糖渣蛋白提取工藝的報道主要集中在堿法，酶法、堿酶或雙酶分步法。堿法提取的是80%的堿溶性谷蛋白，酶法提取的是水溶性蛋白、醇溶蛋白及難溶性蛋白，且抗氧化活性可以得到很好的保持，采用酶法提取反應條件溫和，反應的固液比小，提取率不高，純度也較低，但酶法提高了蛋白質的溶解性，蛋白經部分酶解提高了營養價值，有利于消化、吸收，而且糖渣蛋白特定肽鏈的降解還可能產生具有多種活性的生物活性肽，具有更高的開發價值[11]。

4）正交優化堿性蛋白酶的催化條件，可以有效提升玉米淀粉糖渣中谷氨酸、亮氨酸等的含量，對玉米淀粉糖渣的開發和企業廢渣的有效利用提供了理論依據，但提取率還有些低，有文獻報道采用中性蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶法水解大米糖渣，可以提高蛋白質的提取率，并使蛋白質中多種呈味氨基酸和功能性小肽的含量增加[12]，該方法也是玉米淀粉糖渣今后可以進一步研究的方向。

[1]高東寧,曹磊,許贛榮.以玉米淀粉糖渣為原料制備米曲發酵醬油[J].生物加工過程,2011,5(3)61-65

[2]陳中愛,曾海英,董宏偉酶法提取糖渣蛋白的工藝研究[J]食品科技,2011,6(38):236-241

[3]中華人民共和國衛生部.GB/T5009.5-2010食品中粗蛋白含量的測定[S].北京:中國標準出版社,2010

[4]中華人民共和國衛生部.GB/T14772-2008食品中粗脂肪含量的測定[S].北京:中國標準出版社,2008

[5]中華人民共和國衛生部.GB/T5009.3-2010食品中水分的測定[S].北京:中國標準出版社,2010

[6]中華人民共和國衛生部.GB/T5009.4-2010食品中灰分的測定[S].北京:中國標準出版社,2010

[7]中華人民共和國衛生部.GB/T5009.5-2010食品中氨基酸的測定[S].北京:中國標準出版社,2003

[8]高東寧.玉米淀粉糖渣為原料培養米曲和紅曲及醬油釀造[D].無錫:江南大學,2010

[9]奚海燕,張暉.大米蛋白的提取及改性研究[D].無錫:江南大學, 2008

[10]奚海燕,張暉,姚惠源.堿酶分步法從米粉中提取大米蛋白工藝的研究[J].糧油食品科技,2007,15(6):12-14

[11]吳欣欣,玉米蛋白酶解物抗氧化活性研究[D].鄭州:河南工業大學,2013

[12]李綺麗,吳衛國,張喻,等雙酶法水解米渣蛋白工藝研究[J].糧食與油脂,2011(1):19-22

Component Analysis of Corn Starch Cake and Enzymatic Extraction of Protein Optimization Technology

ZUO Ying1，ZHANG Ping1，CAO Xue-dan2，ZHANG Hui1，ZHANG Xin-hua3
（1.Department of Biotechnology and Pharmaceutical Technology of Ningxia Polytechnic，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2.Institute of Citrus，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Taizhou 318020，Zhejiang，China；3.Aksu Prefecture Agricultural Technology Promotion Center，Aksu 843000，Xinjiang，China）

Using enzymatic hydrolysis of the Corn starch cake in the protein as the research object and optimizing process conditions of the enzymatic protein extraction，the results showed that the protein content of corn starch cake in the highest 33.1 g/100 g，especially glutamic acid and leucine amino acid content was higher，which conform to basic requirements of being developed into a seasoning or food additives；proteins were extracted by different enzymes hydrolysis corn stach cake.The results showed that the highest extraction rate of 29.02%alkaline protease；Using single factor analysis combined with the optimization of separation technology of protein sugar dregs in orthogonal experiment；results for the extraction temperature 45℃，pH 11.5，1%of the amount of enzyme，the material liquid ratio 1∶11，extraction time 3 h，extraction rate can reach 39.77%.The protein amino acid composition analysis showed Glutamic acid，leucine content than the sugar content in slag increased most，up to 8.332 and 6.089 respectively，it the value of development and utilization and potential.

corn starch cake；enzymatic；extract protein

2014-07-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.023

寧夏職業技術學院重點課題支持項目“催化玉米淀粉糖渣水解的酶品種的篩選研究”（XJ201202）；寧夏職業技術學院設施園藝無土栽培技術創新中心（培育）項目支持

左瑩（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：植物加工利用。