DNA條形碼技術在雙翅目昆蟲中的應用

閆嬌，姜麗，郭琴，王新華，閆春財

（1.天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；2.南開大學生命科學學院，天津300071）

DNA條形碼技術在雙翅目昆蟲中的應用

閆嬌1，姜麗1，郭琴1，王新華2，閆春財1

（1.天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；2.南開大學生命科學學院，天津300071）

雙翅目昆蟲為完全變態發育，多個物種幼蟲和蛹形態相似、同一物種不同發育階段數據缺乏等問題都為雙翅目昆蟲的物種鑒定帶來困擾.DNA條形碼技術的有效性已被證實，廣泛應用于分類學等多個領域.本文概述了DNA條形碼技術在雙翅目昆蟲中的應用以及對該技術和方法提出的改進.

DNA條形碼；線粒體COI基因；雙翅目

雙翅目是昆蟲綱中僅次于鞘翅目、鱗翅目、膜翅目的第4大目，包括蠅、蚋、蚊、蠓等，物種豐富，分布廣泛.雙翅目昆蟲會引發或傳播人類某些重大疾病，如馴鹿皮蠅（Hypoderma tarandi）可造成眼內蠅蛆病[1]；蚊子吸人畜血液，是蟲媒病傳播過程中重要的媒介生物[2].雙翅目昆蟲對農林畜牧業也有重要影響，如南美斑潛蠅（Liriomyza huidobrensis）是對蔬菜和園藝作物造成重大損失的害蟲[3]；蕈蚊科昆蟲能為植物完成授粉作用[4]；Lixadmontia franki Wood&Cave幼蟲（寄蠅科）寄生在象鼻蟲（Metamasius callizona）體內，是噬咬鳳梨科植物的入侵象鼻蟲害蟲的重要天敵，可作為害蟲生物控制的調節者[5].有些雙翅目昆蟲可以作為水體污染的指示生物，如搖蚊科幼蟲的生態需求和生活習性因種屬的不同而存在差異，對環境因子敏感性也不同，是水環境監測的優良指示生物[6].可見，雙翅目昆蟲與人類生活息息相關，具有重要的研究價值.

DNA條形碼技術自2003年提出以來發展迅速，被廣泛應用于動植物的分類鑒定[7-14].同傳統的形態學分類鑒定相比，DNA條形碼技術的優勢在于其不受實驗對象的雌雄和發育階段的限制，不受表型可塑性和遺傳可變性的影響，對鑒定者本身也沒有嚴格的專業背景要求[15].在動物分類學研究方面選用的基因序列，首選線粒體基因（COI、COⅡ），其次是核糖體內轉錄間隔區基因（ITS-1，ITS-2）、5.8S rDNA、EF-1α基因、白眼基因（White gene）和CAD基因等.在雙翅目昆蟲的研究中，DNA條形碼技術主要應用于物種鑒定和系統發育分析，本文從以下5方面對其進行綜述.

1 DNA條形碼技術在物種鑒定中的應用

傳統分類學方法的局限主要有3方面：①表型可塑性和遺傳多樣性會導致物種的錯誤鑒定；②對于變態發育的雙翅目昆蟲來說，形態學鑒定的特征大多只針對雄成蟲，而雌成蟲和幼蟲等發育階段因形態相似難以鑒定到種；③分類學專業術語以及特征的判斷需要專業的知識背景.而以DNA序列為基礎的分子分類可以為分類學帶來進一步的發展，如鑒定物種、發現新種和隱存種等.目前，DNA條形碼技術在蠓科、蚋科、實蠅科、搖蚊科、蚊科等多個雙翅目類群中的鑒定均有報道[16-29].

Meeyen等[16]利用COI基因對辣椒實蠅（Bactrocera latifrons，實蠅科）進行了分子分類鑒定，鑒定成功率為100%，證實了COI基因作為DNA條形碼技術分子標記的有效性.朱振華等[17]選用mtDNA CytB基因，以果實蠅屬的桔小實蠅（Bactrocera dorsalis）、瓜實蠅（B. cucurbitae）、南瓜實蠅（B.tau）、番石榴實蠅（B. correcta）、具條實蠅（B.scutellata）、黑漆實蠅（B. scutellaris）等6種實蠅為實驗對象，經分析得出，mt DNA CytB基因片段有30個位點穩定性較高，種內遺傳距離為0～0.019，種間遺傳距離為0.059 24～0.191 33，種間差異大于種內差異，因此mtDNA CytB基因可作為這6種實蠅分子鑒別的依據.Gao等[18]利用條形碼技術，選用COI基因，鑒定出云南地區果蠅科Luzonimyia屬和Pararhinoleucophenga屬各2個果蠅新種，An等[19]也鑒定出云南地區果蠅科Phortica屬Ashima亞屬的3個新種.臺灣地區冠果蠅屬（Stegana Meigen）的種類在形態分類中數據欠缺，Zhang等[20]利用COI基因（568～708 bp），結合形態觀察，將其鑒定至種，為今后冠果蠅屬的物種鑒定提供了分子依據和形態學依據.Guo等[21]同時采用COI基因（700 bp）和period基因（678 bp）鑒定麻蠅科（Sarcophagidae）物種，結果表明，同時選用線粒體COI基因和核基因period基因時，物種鑒定會更準確.

Nielsen等[22]利用COI基因片段和形態學鑒定相結合，發現了蠓科（Ceratopogonidae）庫蠓亞屬（subgenus Culicoides）的3個新種.Stur等[23]將條形碼技術和形態學方法相結合，選用COI序列對挪威芬馬克地區的蠓科9屬54種223個樣本進行研究的結果表明，除3個形態種含有多個條形碼索引號（Barcode Index Numbers，BINs），可能存在隱存種之外，其他物種的DNA條形碼數據與形態學鑒定結果一致，表明COI基因在蠓科物種鑒定中的有效性.Nielsen等[24]用ITS-1序列對蠓科（Ceratopogonidae）庫蠓屬（Culicoides）進行物種鑒定，表明ITS-1基因在蠓科物種鑒定中的有效性.Renaud等[25]選用蠅科（Muscidae）25屬160種1 114個樣本，擴增COI序列，構建數據庫，為今后鑒定蠅科物種提供依據.以往根據形態學特征很難將黑蠅的幼蟲鑒定到種，Pramual等[26]將泰國地區黑蠅未知幼蟲與已知成蟲COI基因序列進行比對，結果顯示未知幼蟲為Simulium chaliowae和S.bullatum，這表明條形碼技術能將黑蠅幼蟲與成蟲階段相匹配，從而為幼蟲的物種鑒定提供依據.赫坎按蚊種團（Hyrcanusgroup）中物種關系密切且廣泛分布于東洋區和古北區，Ma等[27]利用ITS-2序列對其進行物種鑒定，實驗擴增ITS-2片段長度為436～469 bp，種內差異0～0.4%，遠小于種間差異，因此ITS-2可作為赫坎按蚊種團物種鑒定的分子標記.

Carew等[28]選用COI和CytB基因片段對搖蚊科昆蟲進行物種鑒定，結果顯示COI基因（395 bp）平均種內核酸差異為0～4.2%，平均種間差異為8.7%～34.1%；CytB基因（343bp）平均種內核酸差異為0～4.4%，平均種間差異為7.0%～34.1%，種間差異遠高于種內差異.COI和CytB基因片段均可有效鑒定搖蚊科物種，但COI基因鑒定成功率（96%）高于CytB基因鑒定成功率（83%），而同時選用COI和CytB基因時，鑒定成功率高達99%.搖蚊科物種豐富，但在評估物種豐富度時，由于雌蟲在形態上不易鑒定，研究的主體往往只是雄蟲.鑒于一些搖蚊物種是孤雌生殖，忽略雌蟲就可能造成評估不準確，Ekrem等[29]利用DNA條形碼技術對采自挪威中部保護區的搖蚊雌雄成蟲進行物種鑒定，并將同一物種的雌雄成蟲進行匹配，77.6%的雌蟲可鑒定到種，其余雌蟲僅能鑒定到屬.結果表明，當把雌蟲考慮在內時，記錄種的數量增加了27%，使評估得到的物種豐富度數據更加真實.

2 DNA條形碼技術在系統發育分析中的應用

DNA條形碼本身不能用于系統發育分析，但由于DNA條形碼獲得的基因序列具有物種差異性，因此可用來構建系統發育樹，進行系統發育分析.Sari等[30]用COI基因（653 bp）對搖蚊科各亞科（26屬70種）進行了系統發育分析，最大似然法（ML）分析顯示，除長足搖蚊亞科（Tanypodinae）以外，其他亞科均為單系；搖蚊亞科（Chironominae）與直突搖蚊亞科（Orthocladiinae）為姐妹群.在搖蚊族（Chironomini）中，除多足搖蚊屬（Polypedilum）外，搖蚊屬（Chironomus）、隱搖蚊屬（Cryptochironomus）、內搖蚊屬（Endochironomus）和間搖蚊屬（Paratendipes）均為單系.在長跗搖蚊族（Tanytarsini）中，擬長跗搖蚊屬（Paratanytarsus）和枝長跗搖蚊屬（Cladotanytarsus）為單系，長跗搖蚊屬（Tanytarsus）和小突搖蚊屬（Micropsectra）非單系.而無突搖蚊屬（Ablabesmyia Pentaneurini）在鄰接法（NJ）分析中為單系，在ML分析中為非單系.Wang等[31]選用28S rDNA序列中高變區D1序列（28S rDNA D1），以長足搖蚊亞科中（Tanypus punctipennis）和（Procladius choreus）為外群，用鄰接法和最大簡約法（MP）構建系統發育樹，對直突搖蚊亞科中12個代表性屬級階元進行分子系統學研究.結果表明，心突搖蚊屬（Cardiocladius）和真開氏搖蚊屬（Eukiefferiella）聚為一支，流環足搖蚊屬（Rheocricotopus）和刀突搖蚊屬（Psectrocladius）聚為一支.結果與基于形態學的系統發育分析一致.

Jiang等[32]選取73個果蠅種的1 426個個體，利用NJ法、BM法、BCM法和MD法對條形碼數據進行分析，結果顯示種間平均距離為14.04%，種內平均距離為0.81%.另外，果蠅復合體存在時，條形碼鑒定成功率下降，其中BM法和BCM法成功率為74.4%，MD法為84.8%.若將復合體作為單一類群可獲得較高成功率（BM 98.9%，BCM 98.5%，MD 97.5%）.從系統樹可看出，Bactrocera dorsalis復合體、B.tryoni復合體、B. mesomelas（Bezzi）、B.calumniata（Hardy）、B.cucurbitae和B.tau（Walker）中的大多數物種為并系，B.dorsalis復合體中的B.cognata（Hardy&Adachi）和B.trivialis（Drew）為多系類群，B.zonata復合體中的B.correcta（Bezzi）、B.tuberculata（Bezzi）、B.zonata（Saunders）和B. tau復合體中的B.bezziana（Hering）、B.tau互為單系類群.

Jamnongluk等[33]用COI序列探討果實蠅屬（Bactrocera）中4亞屬（Asiadacus、Bactrocera、Hemigymnodacus、Zeugodacus）的分子系統關系.分別用MP法和NJ法（Jukes-Cantor模型）構建系統發育樹，所得系統樹的拓撲結構非常相似.結果顯示所有序列明顯分為2支：Asiadacus、Hemigymnodacus和Zeugodacus聚為1支，Bactrocera單獨為1支.相比于Bactrocera而言，Asiadacus、Hemigymnodacus和Zeugodacus相互之間關系更密切.分子系統分析結果符合形態分類結果.Bourke等[34]用COI（638 bp）、ITS（432 bp）、白眼基因（716 bp）這3個基因片段，對Anopheles strodei亞群進行鑒定并分析其系統發育關系.分別用貝葉斯法建樹，選用COI的53個片段，選用ITS的49個片段，選用白眼基因的57個片段，外群為A.kompi Edwards、A.lutzii Cruz和A.galvaoi Causey.COI基因鑒定成功率為92%，但不能鑒定出A.albertoi和A.strodei；ITS-2鑒定成功率為60%.使用多重位點COI-ITS-2時，鑒定成功率為100%.貝葉斯法分析顯示，系統發育樹分為7支，與原有研究一致.

3 DNA條形碼技術在其他方面的應用

3.1 DNA條形碼技術在法醫學中的應用

蠅科、麗蠅科、麻蠅科和小家蠅科等均為雙翅目嗜尸性昆蟲，因此根據其生活特性，可用來推測兇殺案的案發時間與發生時間的間隔（the postmortem interval，PMI），為刑偵學提供線索.在法醫學中，測定尸體上不成熟期蠅類的發育齡期是估計PMI的關鍵. Sonet等[35]認為，以DNA分析為基礎，利用COI序列對各個發育階段的蠅類進行有效物種鑒定是十分必要的.Jordaens等[36]以麻蠅科麻蠅屬56種126個樣本為實驗對象，結合GenBank數據，共分析99種270個COI片段，結果表明迷你條形碼（127 bp）的成功率較低（80.7%～82.7%），但658 bp的COI序列和COI全長（1 535 bp）在嗜尸性昆蟲麻蠅屬鑒定中成功率高達98.2%～99.3%.Meiklejohn等[37]分析了澳大利亞麻蠅科16種85個樣本，結果顯示：種間差異為6.658%～8.983%，種內差異為0～1.499%，條形碼間隔（gap）明顯，96.5%的標本可成功鑒定到種，COI序列可作為澳大利亞麻蠅科分子鑒定的有效工具.Boehme等[38]用條形碼技術鑒定了蚤蠅科6種（Megaselia scalaris、M. giraudii、M.abdita、M.rufipes、Conicera tibialis、Puliciphoraborinquenensis）.對法醫學而言，麻蠅物種鑒定可能因不同地區環境及群落結構的差異而導致錯誤鑒定.Guo等[39]在中國10個省市13個采樣位點采集到23個麻蠅樣本，采樣范圍東至山東臨沂（35°05′E，118°35′N），西北至新疆烏魯木齊（43°46′E，87°36′N），南至海南萬寧（18°80′E，110°39′N）.實驗選用COI基因（278 bp）和16S rDNA（289 bp）這2個基因片段，結果顯示所獲樣本為4個種，分別為Boerttcherisca peregrina、Helicophagellamelanura、Parasarcophaga albiceps和Parasarcophaga dux.系統樹中節點支持率高，表明COI和16SrDNA可對麻蠅進行有效物種鑒定.

3.2 DNA條形碼技術在環境保護中的應用

Brabrand等[40]為了解黑蠅（Simulium truncatum）在挪威Agardselva河流域每年爆發的原因，利用DNA條形碼技術對采樣獲得的卵和幼蟲進行物種鑒定，從而得出S.truncatum產卵和卵孵化的主要區域，同時將此物種卵的主要分布區域與S.venustum類群中其他物種區域相區分.通過對比該區域的環境因素，發現這些區域之間明顯沿著一條人工河渠分布，由此解釋了S.truncatum的爆發原因，這表明條形碼技術對水體環境的變化及監測有重要意義.

生物入侵是環境多樣性和生態平衡的重要威脅[41].因此在進出口的檢疫工作中，需要將未知物種（包括蛹、幼蟲、成蟲）迅速并有效鑒定，判斷其是否為入侵物種.由于在形態分類學鑒定中，蛹和幼蟲鑒別特征不明顯，給檢疫工作帶來困擾，而DNA條形碼技術可以解決這些難題.Uechi等[42]發現日本沖繩縣（Okinawa Prefecture）的2種植物（Pseuderanthemum laxiflorum、Jasminum sambac）和三重縣（Mie Prefecture）的1種植物（Dendrobium spp.）花蕾均被癭蚊感染，經過形態學鑒定和分子鑒定發現Contariniamaculipennis為日本入侵物種，且在該地區為首次記錄.Hu等[43]利用COI基因（782 bp）對中國入侵物種瓜實蠅（Bactrocera cucurbitae Coquillett）進行了分子研究，揭示中國沿岸7個地理種群的基因多樣性極低，在取樣范圍內，發現亞洲東南部的瓜實蠅實為1個世系.實蠅科昆蟲中包括一些重要的農業害蟲，為給檢疫工作提供便利，Li等[44]基于DNA條形碼建立了TBIS網站（Tephritid Barcode Identification System），含實蠅科150種400個COI序列，后期將逐漸添加形態學特征描述以及圖片介紹、寄主和地理分布等具體內容，以期成為檢疫技術的有力工具.綜上所述，DNA條形碼對物種鑒定的有效性可以為生物入侵的檢測與控制提供新的支持.

3.3 DNA條形碼技術在醫學和畜牧學中的應用

在人畜傳染病中，蟲媒病較多.雙翅目昆蟲如蠓、蚋、蚊、虻類等吸食人畜血液，是細菌、病毒等病原生物得以傳播和擴散的媒介.蚊子作為媒介引起的登革熱早已引起關注，但在巴基斯坦，鮮有人研究蚊類多樣性.由于種間形態差異較小，很難評估該地區的蚊類多樣性和分布.直到2014年，Ashfaq等[45]選用COI序列，在該地區成功分析1 684個樣本（成功率87%），其中致倦庫蚊（Culex quinquefasciatus）占61%，伊蚊屬（Aedes）種類占15%（A.albopictus和A.aegypti為優勢種），瘧蚊屬（Anopheles）占6%.根據形態學特征可鑒定出21種，如將所得基因序列與生命條形碼數據系統（Barcode of Life Data Systems，BOLD）及GenBank數據對比，可增加記錄11種，其種內差異為0～2.4%，種間差異為2.3%～17.8%.

蠓科庫蠓屬（Culicoides）的一些種類是藍舌病病毒的中間媒介，在北歐地區曾引發大規模藍舌病.Lassen等[46]用COI序列對Culicoides的種類進行分析，表明其種內差異＜1%，COI序列可成為庫蠓屬的分子標記. Lassen等[47]對庫蠓屬昆蟲的吸食血液進行分子鑒定，表明庫蠓屬常見寄主為牛、狍、馬、野鴨及斑鳩等，其中牛占73.9%，斑鳩占18.3%，表明其在選擇寄主時具有偏向性.

4 DNA條形碼技術的改進

獲取DNA條形碼數據的主要步驟為：提取總DNA；PCR擴增目標片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測，微量蛋白核酸儀檢測目標片段的純度；將電泳所得片段進行割膠回收純化，測序；最后將測序序列進行數據分析和處理，包括登錄NCBI網站進行BLAST比對，分析序列的堿基組成并計算簡約信息位點、保守位點、變異位點的個數以及替代顛換飽和度分析，可構建系統發育樹.提取總DNA時可采用傳統方法（如CTAB、NaCl、SDS法）和試劑盒法.

從標本到DNA條形碼分子標記的獲得耗時費力，Wong等[48]以搖蚊為實驗材料，省去DNA提取相關步驟，做直接PCR（directPCR），證明優化后的成功率高達90%.實驗高成功率的關鍵在于選取組織的質量、身體部位、所用引物和Taq酶類型等方面.特別指出取材對直接PCR的成功率有直接影響：取成蟲足進行直接PCR的成功率（100%）要遠高于整只取材（成蟲體長＞2.5mm時，成功率為0）.對其他無脊椎動物類群的研究中發現直接PCR技術并不適用于外骨骼加厚及外分泌腺過多的昆蟲.

實驗材料放置時間過久容易造成DNA降解，導致基因提取和PCR成功率下降，無法獲得目標片段.因此對于保存已久的樣本，DNA條形碼技術無法體現其優勢.Hernandez-Triana等[49]研究博物館內保存已久（保存時間大于10 a）的蚋科樣本（2屬36種271個樣本）時，選用6個不同的引物對進行擴增，結果從215個樣本中獲得了有效序列，如表1所示.該研究強調了當實驗材料保存過久時必須選用合適的引物對組合才能得到目的片段.

表1 引物對的選用及成功率Tab.1 Primer pairsadopted to obtain shortbarcode sequencesand success rates

Kim等[50]認為種間和種內樣品量的不足以及類群間的突變可能會影響DNA條形碼間隙的解釋和分析，使用新的指標則能夠迅速和準確地評估DNA條形碼間隙.使用新指標界定條形碼間隙時，能夠鑒定出隱存種.在韓國搖蚊數據庫里，Dicrotendipes pelochloris種間差距明顯（種間距離0.138，種內距離0.050，條形碼間隙IndexBarcodeGap0.341），但Cricotopus tricinctus差異不明顯（種間距離0.010，種內距離0.004，IndexBarcodeGap0.967），因此Kim等定義了DM值，該DM值為平均種間遺傳距離，依賴于目標物種的遺傳變異和數據庫.DM-最小種間遺傳距離（DminInter）和DM-最大種內遺傳距離（DmaxIntra）可以避免當種內變異為0時，DNA條形碼間隙被錯誤解釋.運用此概念，計算出IndexBarcodeGap和最佳臨界值IndexCutoff，檢測了7個昆蟲條形碼數據庫Profile 100 Insect Families、Ephe-meroptera of North America（EPCHU）、Trichoptera of Churchill 2002-2007、Chilean Smicridea、Caddisflies of New Zealand、Moths of Ontario和BOLD Chironomids的有效性，進而鑒定出14個隱存種，結果如表2所示.

表2 利用新指標鑒定出的隱存種Tab.2 Summary of COI genetic divergence to predict cryptic species in insect datasets

5 結語

DNA條形碼技術是一種能夠對物種進行快速、有效鑒定的工具，在動植物分類鑒定中具有重要作用，為分類學研究開辟了新途徑.DNA條形碼自提出以來備受關注，得到多個領域學者的支持.在昆蟲分類學研究中，DNA條形碼不受蟲態限制，對實驗對象形態完整性沒有要求（部分組織器官、血液等均可）；它操作簡便，可大批量同時進行，大大簡化了繁重的物種鑒定工作.常用的分子標記基因COI、COⅡ和ITS片段等可直接采用其通用引物進行擴增，物種不同不需重新設計引物.隨著DNA條形碼技術的發展，迷你條形碼、直接PCR、下一代測序技術等的提出與應用均為這項技術添加了新的活力.DNA條形碼不僅能進行物種鑒定，還能進行系統發育分析.在雙翅目昆蟲的應用中，為進化生物學、醫學、畜牧學、法醫學、生態學、進出口檢疫等的研究和應用奠定了基礎.

然而在其廣泛應用中，不足之處也逐漸顯現：①核基因組中線粒體假基因（NUMTs）的干擾，會導致實驗結果出現假陽性，可能對物種鑒定和系統發育分析造成錯誤解釋；②目前DNA條形碼對物種界定并沒有統一的標準，普遍認為種間差異大于2%或種間差異大于種內差異10倍時即為不同種，但當種間差異和種內差異不明顯并出現重疊時，DNA條形碼便不能進行有效鑒定；③采用不同基因作為分子標記會影響物種鑒定的有效性以及系統發育樹的構建；④COI基因在鑒定動物物種時成果顯著，但其在植物中進化速率較慢、變異少，因此COI基因不適用于植物的物種鑒定；⑤構建系統樹采用的建樹方法不同時，可能反映的種間、屬間情況不一致[31]；⑥DNA條形碼不能有效鑒定一些較小類群[51]，不能客觀解釋一些類群的系統發育關系[52]；⑦采用不同引物對獲得目標片段的成功率可能有影響，采樣量大小也可能對結果有影響.

盡管DNA條形碼技術有不足之處，但不可否認的是它在多個類群中均具有效性.DNA條形碼技術不可能完全取代形態學分類方法，它可以作為形態學鑒定的輔助工具，為傳統的物種鑒定提供分子依據.也就是說，將形態學分類與分子分類相結合，會使物種鑒定結果更科學更準確，這是分類學發展的方向.目前交叉學科的興起和發展為眾多領域帶來生機，DNA條形碼技術可結合生態學、系統學、法醫學、動物行為學、進化生物學、生物地理學等學科，利用學科互補開拓新的研究領域.

[1]RUKKEBA，CHOLIDISS，JOHNSENA，etal.Confirming Hypoderma tarandi（Diptera：Oestridae）human ophthalmomyiasisby larval DNA barcoding[J].Acta Parasitologica，2014，59（2）：301-304.

[2]ENGDAHL C，LARSSON P，NASLUND J，et al.Identification of Swedishmosquitoesbased onmolecular barcoding of the COI gene and SNPanalysis[J].MolecularEcologyResources，2014，14（3）：478-488.

[3]SCHEFFER SJ，LEWISM L，GAIMARISD，etal.Molecular survey for the invasive leafminer pest Liriomyza huidobrensis（Diptera：Agromyzidae）in California uncovers only the native pest Liriomyza langei[J].JournalofEconomic Entomology，2014，107（5）：1959-1964.

[4]PHILLIPSRD，SCACCABAROZZID，RETTER BA，etal.Caught in the act：pollination of sexually deceptive trap-flowers by fungus gnats in Pterostylis（Orchidaceae）[J].Annals of Botany，2014，113（4）：629-641.

[5]COOPERTM，FRANKJH.Descriptionofthe larvalinstarsof Lixadmontia franki（Diptera：Tachinidae）[J].Florida Entomologist，2014，97（3）：1002-1014.

[6]STEIN E D，WHITE B P，MAZOR R D，et al.Does DNA barcoding improve performance of traditional stream bioassessment metrics[J]. Freshwater Science，2014，33（1）：302-311.

[7]LAWTON R J，MATA L，DE NYSR，et al.Algal bioremediation of wastewaters from land-based aquaculture using Ulva：selecting target speciesand strains[J].PLoSOne，2013，8（10）：e77344.

[8]GISMONDIA，FANALIF，LABARGA JMM，etal.Crocussativus L. genomicsand differentDNA barcode applications[J].Plant Systematics and Evolution，2013，229（10）：1859-1863.

[9]SAARELA JM，SOKOLOFF P C，GILLESPIE L J，et al.DNA barcoding theCanadianarctic flora：coreplastid barcodes（rbcL+matK）for490 vascularplantspecies[J].PLoSOne，2013，8（10）：1-36.

[10]WEBSTER B L，WEBSTER J P，GOUVRAS A N，et al.DNA 'barcoding'of Schistosomamansoni acrosssub-Saharan Africa supports substantial within locality diversity and geographical separation of genotypes[J].Acta Tropica，2013，128（2）：250-260.

[11]WEBSTER B L，CULVERWELL C L，KHAMIS I S，et al.DNA barcoding of Schistosoma haematobium on Zanzibar reveals substantial genetic diversity and twomajor phylogenetic groups[J].Acta Tropica，2013，128（2）：206-217.

[12]KULSANTIWONG J，PRASOPDEE S，RUANGSITTICHAI J，et al. DNA barcode identification of freshwatersnailsin the family Bithyniidae from Thailand[J].PLoSOne，2013，8（11）：1-9.

[13]HAWLITSCHEK O，NAGY Z T，BERGER J，et al.Reliable DNA barcoding performance proved for species and island populations of comoran squamate reptiles[J].PLoSOne，2013，8（9）：e73368.

[14]LUOA，ZHANGA，HOSY，etal.Potentialefficacy ofmitochondrial genes for animal DNA barcoding：a case study using eutherian mammals[J].BMCGenomics，2011，12：84-84.

[15]FONTAINEB，VAN ACHTERBERGK，ALONSO-ZARAZAGAM A，etal.New species in the old world：Europe as a frontier in biodiversity exploration，a testbed for21stcentury taxonomy[J].PLoSOne，2012，7（5）：e36881.

[16]MEEYENK，NANORKSOPALADAWANP，PRAMUALP.Population structure，population history and DNA barcoding of fruit fly Bactrocera latifrons（Hendel）（Diptera：Tephritidae）[J].Entomological Science，2014，17（2）：219-230.

[17]朱振華，葉輝，張智英.基于mtDNA Cytb的六種果實蠅的分子鑒定（雙翅目：實蠅科）[J].昆蟲學報，2005，48（3）：386-390.

[18]GAO Q，CHEN H.The genera Luzonimyia and Pararhinoleucophenga from China（Diptera：Drosophilidae），with DNA barcoding information [J].Zootaxa，2014，3852（2）：294-300.

[19]AN K，CAO H，WANG X，et al.The subgenus Ashima（Diptera，Drosophildae，Phortica）from China，with DNA barcoding and descriptions of three new species[J].Systematics and Biodiversity，2015，13（1）：42-51.

[20]ZHANG Y，TSAUR SC，CHEN HW.Survey of the genus Stegana Meigen（Diptera，Drosophilidae）from Taiwan，with DNA barcodesand descriptionsof threenew species[J].ZoologicalStudies，2014，53：2-17.

[21]GUOY，ZHA L，YANW，etal.Identification of forensically important sarcophagid flies（Diptera：Sarcophagidae）in Chinabased on COI and period gene[J].International Journal of Legal Medicine，2014，128（1）：221-228.

[22]NIELSENSA，KRISTENSENM.Delineation of Culicoides species by morphology and barcode exemplified by three new species of the subgenus Culicoides（Diptera：Ceratopogonidae）from Scandinavia[J]. Parasites&Vectors，2015，8（1）：151-162.

[23]STUR E，BORKENTA.When DNA barcoding andmorphologymesh：Ceratopogonidae diversity in Finnmark，Norway[J].Zookeys，2014（463）：95-131.

[24]NIELSEN SA，KRISTENSENM.Morphological andmolecular identification ofspeciesof theobsoletusgroup（Diptera：Ceratopogonidae）in Scandinavia[J].ParasitologyResearch，2011，109（4）：1133-1141.

[25]RENAUD A K，SAVAGE J，ADAMOWICZ S J.DNA barcoding of Northern Nearctic Muscidae（Diptera）reveals high correspondence betweenmorphological andmolecular species limits[J].BMC Ecology，2012，12：24-39.

[26]PRAMUAL P，WONGPAKAM K.Association of black fly（Diptera：Simuliidae）life stages using DNA barcode[J].Journal of Asia-Pacific Entomology，2014，17（3）：549-554.

[27]MA Y J，XU J.The Hyrcanus group of Anopheles（Anopheles）in China（Diptera：Culicidae）：species discrimination and phylogenetic relationships inferred by ribosomal DNA internal transcribed spacer 2 sequences[J].JMed Entomol，2005，42（4）：610-619.

[28]CAREWME，PETTIGROVEV J，METZELINGL，etal.Environmental monitoring using next generation sequencing：rapid identification of macroinvertebrate bioindicator species[J].Front Zool，2013，10（1）：45-50.

[29]EKREM T，STURE，HEBERTPDN.Femalesdo count：documenting chironomidae（Diptera）species diversity using DNA barcoding[J]. OrganismsDiversityand Evolution，2010，10（5）：397-408.

[30]SARIA，DURAN M，SEN A，et al.Investigation of Chironomidae（Diptera）relationships usingmitochondrial COI gene[J].Biochemical Systematicsand Ecology，2015，59：229-238.

[31]WANGQ，WANGXH.Molecularphylogenetic analysison somegenera of the subfamily Orthocladiinae（Diptera，Chironomidae）based on D1 variable region of 28S ribosomal DNA[J].Acta Zootaxonomica Sinica，2011，36（1）：93-98.

[32]JIANGF，JINQ，LIANG L，etal.Existenceofspecies complex largely reduced barcoding success for invasive species of Tephritidae：a case study in Bactrocera spp.[J].Molecular Ecology Resources，2014，14（6）：1114-1128.

[33]JAMNONGLUKW，BAIMAIV，KITTAYAPONGP.Molecularevolution of tephritid fruit flies in the genus Bactrocera based on the cytochrome oxidase Igene[J].Genetica，2003，119（1）：19-25.

[34]BOURKE B P，OLIVEIRA T P，SUESDEK L，et al.A multi-locus approach to barcoding in the Anopheles strodei subgroup（Diptera：Culicidae）[J].Parasites&Vectors，2013，6：111-127.

[35]SONETG，JORDAENSK，BRAET Y，et al.Utility of GenBank and the Barcode of Life Data Systems（BOLD）for the identification of forensically important Diptera from Belgium and France[J].Zookeys，2013，365：307-328.

[36]JORDAENS K，SONET G，RICHET R，et al.Identification of forensically important Sarcophaga species（Diptera：Sarcophagidae）using themitochondrial COI gene[J].Int JLegalMed，2013，127（2）：491-504.

[37]MEIKLEJOHN K A，WALLMAN J F，DOWTON M.DNA-based identification of forensically important Australian Sarcophagidae（Diptera）[J].International Journalof LegalMedicine，2011，125（1）：27-32.

[38]BOEHME P，AMENDT J，DISNEY R H L，et al.Molecular identification of carrion-breeding scuttle flies（Diptera：Phoridae）using COI barcodes[J].International Journal of LegalMedicine，2010，124（6）：577-581.

[39]GUO Y D，CAIJF，WANG X H，et al.Identification of forensically importantSarcophagid Flies（Diptera：Sarcophagidae）in China，based on COI and 16S rDNA gene sequences[J].Journalof Forensic Sciences，2011，56（6）：15-18.

[40]BRABRAND A，BREMNES T，KOESTLER A G，et al.Mass occurrence of bloodsucking blackflies in a regulated river reach：localization of oviposition habitat of Simulium truncatum using DNA barcoding[J].RiverResearchand Applications，2014，30（5）：602-608.

[41]COMTETT，SANDIONIGIA，VIARD F，etal.DNA（meta）barcoding of biological invasions：a powerful tool to elucidate invasion processes and helpmanagingaliens[J].Biological Invasions，2015，17（3）：905-922.

[42]UECHIN，YUKAWA J，TOKUDAM，etal.New information on host plants and distribution ranges of an invasive gall midge，Contarinia maculipennis（Diptera：Cecidomyiidae），and itscongeners in Japan[J]. Applied Entomologyand Zoology，2011，46（3）：383-389.

[43]HU J，ZHANG JL，NARDIF，et al.Population genetic structure of the melon fly，Bactrocera cucurbitae（Diptera：Tephritidae），from Chinaand SoutheastAsia[J].Genetica，2008，134（3）：319-324.

[44]LIZM，LIZH，WANG FX，etal.TBIS：aweb-based expert system foridentificationoftephritid fruitfliesinChinabasedonDNA barcode[J]. IFIPAdvances in Information and Communication Technology，2011，346（3）：563-571.

[45]ASHFAQM，HEBERTPDN，MIRZA JH，etal.Analyzingmosquito（Diptera：Culicidae）diversity in Pakistan by DNA barcoding[J]. PLoSOne，2014，9（5）：e97268.

[46]LASSEN S B，NIELSEN S A，SKOVGARD H，et al.Molecular differentiation of Culicoidesbitingmidges（Diptera：Ceratopogonidae）from the subgenus Culicoides Latreille in Denmark[J].Parasitol Res，2012，110（5）：1765-1771.

[47]LASSEN S B，NIELSEN S A，SKOVGARD H，et al.Molecular identification of bloodmeals from bitingmidges（Diptera：Ceratopogonidae：Culicoides Latreille）in Denmark[J].Parasitol Res，2011，108（4）：823-829.

[48]WONGW H，TAY Y C，PUNIAMOORTHY J，et al.‘Direct PCR’optimization yieldsa rapid，cost-effective，nondestructive and efficient method for obtaining DNA barcodes without DNA extraction[J]. Molecular Ecology Resources，2014，14（6）：1271-1280.

[49]HERNANDEZ-TRIANA LM，PROSSER SW，RODRIGUEZ-PEREZ MA，etal.RecoveryofDNA barcodes from blackflymuseum specimens（Diptera：Simuliidae）usingprimersets thattargetavarietyof sequence lengths[J].Molecular Ecology Resources，2014，14（3）：508-518.

[50]KIM S，SONGKH，REEH I，etal.ADNA barcode library for Korean Chironomidae（Insecta：Diptera）and indexesfordefiningbarcodegap[J]. Moleculesand Cells，2012，33（1）：9-17.

[51]FREY JE，GUILL N L，FREY B，et al.Developing diagnostic SNP panelsfortheidentificationoftrue fruitflies（Diptera：Tephritidae)within the limits of COI-based species delimitation[J].BMC Evolutionary Biology，2013，13：106-124.

[52]DEPAQUITJ.Molecularsystematicsapplied to Phlebotomine sandflies：review and perspectives[J].Infection Genetics and Evolution，2014，28：744-756.

（責任編校 紀翠榮）

Application of DNA barcoding in Dipteran insects

YAN Jiao1，JIANG Li1，GUOQin1，WANGXinhua2，YANChuncai1
（1a. College of Life Sciences，1b. Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；2. College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin 300071，China）

Dipteran insects have completemetamorphosis development.It′s hard to diagnose the sibling species due to the similarities in externalmorphology of larva and pupa among differentspeciesand the lack ofdata ofeach developmental stage for the same species.DNA barcoding has been proved to have significant efficiency in species identification in previous studiesand iswidely applied.This paper summarized the applications of DNA barcoding in Dipteran insects.Meanwhile，the improvementsof technology and approacheswere proposed aswell.

DNA barcoding；mitochondrial COI gene；Diptera

Q969

A

2015-02-20

國家自然科學基金資助項目（31101653，31272284）；天津市自然科學基金資助項目（14JCQNJC14600）；天津市高等學校科技發展基金資助項目（20090608）；天津師范大學引進人才基金資助項目（5RL104）；天津市優秀青年教師資助計劃（2013）；大學生創新創業訓練計劃資助項目（2015031，201410065046）.

閆嬌（1990—），女，碩士研究生.

閆春財（1979—），男，副教授，主要從事昆蟲系統學方面的研究. .

1671-1114（2015）03-0066-07