一種脆性X綜合征新檢測方法的應用及探討

姚鳳霞，馮 暄，張為民，韓娟娟，黃尚志

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 中心實驗室， 北京 100730； 2.甘肅省婦幼保健院 遺傳室，甘肅 蘭州 730050； 3.中國醫學科學院 基礎醫學研究所 遺傳室， 北京 100005)

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研究論文

一種脆性X綜合征新檢測方法的應用及探討

姚鳳霞1*，馮 暄2，張為民1，韓娟娟1，黃尚志3

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 中心實驗室， 北京 100730； 2.甘肅省婦幼保健院 遺傳室，甘肅 蘭州 730050； 3.中國醫學科學院 基礎醫學研究所 遺傳室， 北京 100005)

目的建立一種更快捷、準確、簡便的檢測脆性X綜合征的方法。方法用傳統的基因組酶切-PCR法與TP-PCR法同時對26例可疑患兒進行基因檢測。結果基因組酶切PCR法共檢測4例男性患者，其余均未見異常；TP-PCR法不僅檢測出4例男性患者，且檢測出1例女性攜帶者。結論TP-PCR法是一種準確、快速、簡便和相對價廉的方法，可以快速篩查脆性X綜合征的基因診斷方法。

脆性X綜合征；FMR1基因；基因診斷

脆性X綜合征(MIM：309550)是一種主要以智力低下為臨床表現的X連鎖隱性遺傳性疾病，其發病率男性1/1500[1]。絕大多數脆性X綜合征發病機制為FMR1基因5′端非翻譯區(CGG)n三核苷酸重復序異常傳遞而引起[2]。FMR1基因(CGG)n重復拷貝數正常人群為6～52；當(CGG)n重復為53～200拷貝數時為前突變, 見于正常男性傳遞者及女性攜帶者； 而當重復拷貝數超過200為全突變, 此時, 位于(CGG)n上游250 bp處的CpG島多伴有異常甲基化導致此病的發生[3]。前突變經過逐代遺傳有可能變成全突變，并且隨著突變數的增加前突變轉變為全突變的概率會增加。

脆性X綜合征需要從基因水平得以確診，目前的實驗室檢測方法主要包括Southern印記雜交法、基因組DNA特異性酶切、RNA水平PCR法等，以上方法均存在一定的不足。本文對本實驗室新舊方法做對比，尋找一種更為快速、精準的方法來診斷脆性X綜合征病例。

1 材料與方法

1.1 研究對象和DNA提取

26例臨床均表現為智力低下的患者和母親為北京協和醫院兒科遺傳咨詢門診病例，經本人或監護人知情同意后采集外周靜脈血3 mL。26例樣本中包含21例為男性病例，5例為女性病例,5例女性樣本中包含2例可疑患兒的母親。正常男女對照均選用實驗室收集的無智力低下的其他疾病患者。外周血使用基因組DNA 提取試劑盒(qiagen blood DNA mini Kit) 抽提DNA，加入適量的TE 液，充分溶解DNA，核酸定量儀測定DNA濃度，使其控制在50～200 ng/μL,-20 ℃保存。推薦DNA模板濃度在20～80 ng/μL,80 ng/μL最佳。

1.2 基因組酶切PCR法檢測

為了驗證AmplideXTMFMR1 PCR試劑盒檢測脆性X綜合征患者結果的準確性，將26例病例全部用實驗室以前采用的方法即應用患者FMR1基因異常甲基化的特點通過EagⅠ酶酶切待測者的基因組DNA，以酶切產物作為模板進行PCR。具體操作是每個樣品分別取200 ng基因組DNA與酶切緩沖液混合，其中一管加入適量EagⅠ限制性內切酶(Newland公司)，另一管不加入酶，最后用去離子水定容至20 μL，以上混合液37 ℃水浴酶切過夜。使用FMR1基因特異引物對(5′-AGTGCGACCTG TCACCGCCCTTC-3′和5′-GAAACCACGTCACGTGAT CAA-3′)和內對照D2S2163引物進行PCR合成，具體PCR體系的設置為:酶切產物4 μL、GC緩沖液Ⅱ 12.5 μL, dNTP(0.25 mmol/L)2 μL, FMR1和D2S2163引物對各1 μL,25×105U/L DNA聚合酶0.5 μL，最后加水至25 μL。PCR 反應條件: 95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，61 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s擴增30個循環，循環結束后72 ℃充分延伸10 min。 PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色檢測。

1.3 TP-PCR及毛細管電泳

15 μL PCR反應體系中分別加入GC緩沖液11.45 μL, FMR1引物對0.5 μL,FMR1 CGG特異引物0.5 μL, PCR聚合酶0.05 μL,最后加DNA模板2 μL，以上試劑均包含在AmplideXTMFMR1 PCR試劑盒(Asuragen公司)中。配制完成的PCR反應液充分混勻后運行PCR程序， 95 ℃變性5 min,然后(97 ℃ 35 s,62 ℃ 35 s,68 ℃ 4 min)進行10個循環，再進行(97 ℃ 35 s,62 ℃ 35 s,68 ℃ 4 min)20個循環，此間每個循環再加20 s,之后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。取2 μL的PCR反應產物與11 μL的HiDi甲酰胺和2 μL的ROX1000相對分子質量內標充分混勻后，置熱循環儀95 ℃變性2 min，立即放入冰盒中至少2 min。在ABI 3130型基因分析儀上經36 cm毛細管電泳分離。由于PCR體系中含有FMR1基因的熒光引物，同時含有針對CGG重復的熒光引起，對于基因組中出現異常(CGG)n的樣本，不僅可以檢測到FMR1的主峰片段，同時可檢測到CGG錨定引物所擴增的CGG重復產物，電泳結果顯示為“鋸齒”狀的CGG重復峰。

1.4 統計學分析

TP-PCR實驗所得數據經過Genemapper4.0軟件進行分析獲得。CGG重復數的計算=(主峰值-C0)/M0,其中C0為核苷酸長度的校正值，M0為動態校正因子。

2 結果

2.1 基因組酶切PCR結果

有4例男性樣品由于異常甲基化基因組DNA不能被EagⅠ限制性內切酶所切割，未切組和酶切組均可見FRM1基因擴增片段，5例女性樣本和其余17例男性樣本基因組DNA由于含有正常的CGG重復基因組而被EagⅠ限制性內切酶切割，未切組和酶切組比較，酶切組PCR擴增未見FRM1基因特異片段，只擴增出內對照片段；而未切組PCR后則可見FRM1基因片段和內對照片段(圖1)。

2.2 TP-PCR檢測結果

經過對標準CGG重復數為20、29、31、54和119對應的主峰面積，建立線性回歸方程y=m0x+c0,得出本實驗室m0=2.936，c0=229.6，R2=0.999(圖2)。

1,3,5,7,9,11,13,15.PCR products not cut by restriction endonuclease; 2,4,6,8,10,12,14,16.PCR products not cut by restriction endonucleass; ～300 bp band for D2S2163 and ～250 bp band for FMR1; normal for A and B, patients for C～F

圖1 6個待檢樣品用基因組酶切法檢測的瓊脂糖電泳結果圖

Fig 1 Agarose gel of genomic restriction endonuclease-PCR technology for 6 samples

圖2 脆性X綜合征CGG重復數與主峰長度線性回歸圖Fig 2 Linear regression graph between CGG repeat numbers and main peak length

對26個樣品直接TP-PCR顯示， 4例男性樣品和1例女性樣品均可見“鋸齒”狀CGG異常重復峰和異常增大的FMR1主峰片段(1 kb以上)，其余21例樣品的FMR1主峰均在250～300 bp之間，且未見CGG重復峰(圖3)。

3 討論

脆性X綜合征是一種以智力低下為主要臨床表現的X連鎖隱性遺傳病，該病是常見的引起智力低下的病因之一。早在1991年研究發現脆性X綜合征的發病分子基礎為位于Xq27.3上的FMR1基因上游的(CGG)n拷貝數異常導致的[4]。

A.male patient; B.normal mal; C.female carrier

Southern印跡雜交目前雖是FMR1甲基化狀態的金標準，但Southern印跡雜交法最大的缺點是對基因組DNA質量和數量的要求苛刻，且操作程序復雜，敏感性不穩定。另外，Southern印跡雜交對于準確的前突變和正常序列之間區分的能力較弱[5]。基于印記雜交方法的不足，基因組DNA首先被甲基化敏感的限制性內切酶如EagⅠ酶切后，PCR檢測(CGG)n拷貝數。此方法存在酶切不徹底、受高CG含量序列和PCR條件要求高的不足，同時，只能定量分析男性樣本，由于女性兩條X染色體中總會存在一條FMR1基因拷貝數正常，所以對于女性樣本無法檢測[6]。

為了克服以上實驗技術的不足， 2012年開發了一種TP-PCR (CGG triplet-repeat primed (TP)-PCR)方法檢測脆性X綜合征的診斷方法assay[7]。TP-PCR方法的優勢主要在于：1)實驗操作簡便，只需通過一次的PCR擴增，之后行1次毛細管電泳即可完成； 2)此方法具有超強的擴增體系，可擴增>1 300的CGG重復； 3)對于<200CGG重復，可以算出精確重復數，>200CGG重復，標注為“>200”；4)精確區分1個CGG的差異； 5)獨創“錨定引物”PCR擴增，可判斷出女性基因是雜合子還是純合子，以及AGG嵌入數，AGG被認為傳遞了DNA的穩定性，它的存在降低了后代發病的風險； 6)此方法的靈敏度是Southern雜交的5倍，DNA需要量是Southern雜交的1/175。本文圖3顯示A樣本為CGG拷貝數為285的男性全突變患者；B樣本為CGG拷貝數為23的男性正常樣本而C樣本為CGG拷貝數為23和285的女性全突變攜帶者。

本方法針對脆X綜合征特殊的分子基礎進行相應的改進，能確切檢出正常、前突變攜帶者及全突變患者，以及女性患者及攜帶者，具有快速、安全、經濟等特點，且無放射性污染問題，優于上述的其他方法。由于診斷方法簡單及費用合理，可用于脆X綜合征的群體篩查和產前診斷，有良好的臨床應用前景。

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[2] Tarleton J，Kenneson A，Taylor AK，etal. A single base alteration in the CGG repeat region of FMRI：possible effects on gene expression and phenotype[J].J Med Genet，2002，39：196- 200.

[3] Ver kerk AJ, Pieretti M, Sutcliffe JS,etal. Identification of a gene (FMR- 1) containing a CGG repeat coincident with a break point cluster region exhibiling length variation in f ragile X syndrome [J].Cell, 1991,65:905- 914.

[4] Verkerk AJ，Pieretti M，Sutcliffe JS，etal.Identification of a gene(FMR- 1)containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in Fragile X syndrome[J].Cell, 1991，65：905- 914.

[5] Grasso M, Boon EM, Filipovic-Sadic S,etal. A novel methylation PCR that offers standardized determination of FMR1 methylation and CGG repeat length without southern blot analysis [J]. J Mol Diagn, 2014, 16:23- 31.

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Application and investigation of a new genetic technology for fragile X syndrome

YAO Feng-xia1*, FENG Xuan2, ZHANG Wei-min1, HAN Juan-juan1, HUANG Shang-zhi3

(1.Clinical Research Lab, PUMC Hospital, CAMS, Beijing 100730; 2.Medical Genetics Lab, Maternal and Child Health Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730050; 3.Dept. of Medical Genetics, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing 100005, China)

Objective To establish a rapid, correct and available detection method for fragile X syndrome. Methods We used AmplideXTMFMR1 PCR Kit to detect samples from 26 suspected patients including 21 male and 5 female patients. All patients were also studied by using genomic EagI restriction enzyme PCR method for comparison. Results (CGG) n trinucleotide repeat of normal samples was accurately identified by PCR method. There are 5 positive patients of fragile X syndrome which included by 4 full mutation patients and 1 female carrier by TP-PCR while the control method found 4 positive men patients only. Conclusions TP-PCR is a accurate, rapid, simple and inexpensive method. It is a competetive technology for screening fragile X syndrome.

fragile X syndrome;FMR1 gene; gene diagnosis

2014- 03- 04

2014- 12- 29

國家自然科學基金(81000252)

1001-6325(2015)04-0454-04

R394.3：

A

*通信作者(corresponding author)：fxyao77@163.com