戊地昔布通過上調ROS誘導人乳腺癌MCF- 7細胞凋亡

張曼麗，王慧慈，柳金金，于 丁，王紫微，吳佳昕，李軍霞*

(河北醫科大學 1.藥理教研室； 2.第二醫院心外科； 3.2012級七年制臨床醫學， 河北 石家莊 050000；4.滄州市人民醫院 甲乳外科， 河北 滄州 061000)

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研究論文

戊地昔布通過上調ROS誘導人乳腺癌MCF- 7細胞凋亡

張曼麗1,4，王慧慈1，柳金金1，于 丁2，王紫微3，吳佳昕3，李軍霞1*

(河北醫科大學 1.藥理教研室； 2.第二醫院心外科； 3.2012級七年制臨床醫學， 河北 石家莊 050000；4.滄州市人民醫院 甲乳外科， 河北 滄州 061000)

目的探討活性氧 (reactive oxygen species，ROS)在選擇性環氧化酶(cyclooxygenase，COX)- 2抑制劑戊地昔布誘導人乳腺癌MCF- 7細胞凋亡中的作用。方法噻唑藍(MTT) 法檢測細胞增殖；流式細胞術和Hoechst33258檢測細胞凋亡；激光共聚焦顯微鏡觀察細胞ROS和線粒體膜電位；Western blot檢測蛋白表達。結果1)戊地昔布可誘導細胞凋亡(P<0.01)，抑制細胞增殖(P<0.05或P<0.01)。2)給予戊地昔布后, caspase- 3表達先升高，然后降解為cleaved caspase- 3，Bcl- 2的表達降低，Bax的表達增高，caspase- 3 抑制劑Ac-DEVD-CHO和caspase 抑制劑Z-VAD-FMK可拮抗戊地昔布的抗腫瘤作用(P<0.05或P<0.01)。3)戊地昔布可降低線粒體膜電位，明顯提高細胞內的ROS水平。抗氧化劑N-乙酰基半胱氨酸(N-Acetyl-L-cystein，NAC)可拮抗戊地昔布的抗腫瘤作用(P< 0.01)。結論戊地昔布可通過升高細胞內ROS誘導MCF- 7細胞凋亡。

戊地昔布; 環氧化酶- 2; 人乳腺癌MCF- 7細胞; 凋亡；活性氧

環氧化酶(cyclooxygenase，COX)可把花生四烯酸轉化為前列腺素，有兩種亞型COX- 1和COX- 2[1]。COX- 1組成性表達在許多正常組織，參與生理功能的調節，COX- 2可被細胞因子、生長因子和腫瘤啟動子等誘導表達，在腫瘤組織表達增多，參與腫瘤的發生發展[1]。許多研究表明COX- 2抑制劑可抑制腫瘤細胞增生，也可增強化療藥物和放療的敏感性[1]。近年來，活性氧 (reactive oxygen species，ROS)在腫瘤中的作用受到廣泛關注，ROS可通過誘導DNA損傷和激活癌基因等方式促進癌癥發生，但ROS的增高也是誘導腫瘤細胞凋亡的原因之一[2]。戊地昔布(valdecoxib)是一類不良反應小的選擇性COX- 2抑制劑，可抑制多種腫瘤細胞的生長，但ROS在戊地昔布抗腫瘤中的作用尚未有報道[3]。本研究從這一角度出發，探討ROS在戊地昔布抗人乳腺癌MCF- 7細胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

戊地昔布由河北醫科大學藥學院合成(純度99%), 用二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)配成250 mmol/L母液-20 ℃儲存，臨用前稀釋。N-乙酰基半胱氨酸(N-Acetyl-L-cystein，NAC)，Ac-DEVD-CHO，ROS試劑盒、Hoechst 33258試劑盒和JC- 1試劑盒(碧云天生物有限公司)；改良型RPMI1640、胰蛋白酶(Gibco公司)；MTT(Sigma公司)；Z-VAD-FMK，β-actin抗體(Santa Cruz公司)；caspase- 3，cleaved-caspase- 3，Bax和Bcl- 2抗體(Affbiotech公司)；二抗(Rockland公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：人乳腺癌MCF- 7細胞由河北醫科大學藥理室傳代培養。將細胞置于含10%胎牛血清、1×105IU/L青霉素及鏈霉素的改良型RPMI-1640 培養液中，于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養。

1.2.2 MTT法檢測戊地昔布對細胞增殖的影響：取對數增殖期的細胞，用胰蛋白酶消化，按1×104個/孔接種于96 孔板，待細胞貼壁后, 吸去上清，加入戊地昔布200 μL。同時設陰性對照和溶劑對照，于培養后不同時間加入MTT(5 g/L) 20 μL。繼續培養4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩，測570 nm的A值，計算生長抑制率。

1.2.3 MTT法檢測NAC，Ac-DEVD-CHO，Z-VAD-FMK對戊地昔布作用的影響：同上處理細胞。NAC濃度為5 mmol/L，Ac-DEVD-CHO和Z-VAD-FMK濃度為20 μmol/L，上述藥物提前孵育2 h，然后加入戊地昔布，戊地昔布濃度為200 μmol/L，繼續孵育48 h，其余同上。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡：實驗結束后，收集細胞，PBS 洗3次，用乙醇固定，PI 染液4℃避光染色30 min，上機檢測細胞凋亡。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡檢測細胞凋亡、線粒體膜電位和ROS水平：將細胞培養在加入蓋玻片的24孔板中，給予戊地昔布，實驗結束后，按Hoechst 33258試劑盒、JC- 1試劑盒和ROS試劑盒步驟檢測。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達：收集各組細胞，加入蛋白裂解液，冰上放置30 min，4 ℃ 12 000×g離心, 取上清液用考馬斯亮藍試劑盒定量蛋白，變性。上樣量為每孔40 μg，10% SDS-PAGE(變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離蛋白，電轉移至硝酸纖維素膜上，5% 脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，一抗1∶500稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗1∶5 000稀釋，37 ℃孵育1 h，掃描并分析圖像。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 戊地昔布對MCF- 7細胞增殖的抑制作用

25～400 μmol/L戊地昔布可抑制MCF- 7細胞的增殖，隨時間的延長和濃度的增加，抑制作用明顯增加(P<0.05或P<0.01)(圖1)。

2.2 戊地昔布可誘導細胞凋亡

戊地昔布可明顯誘導MCF- 7凋亡(P< 0.01)。戊地昔布作用后細胞呈典型的凋亡形態，核染色質熒光增強，濃縮邊聚，呈新月狀(圖2)。

SC:solvent control; *P<0.05，**P<0.01 compared with control圖1 戊地昔布對MCF- 7細胞增殖的抑制作用Fig 1 The effect of valdecoxib on the proliferation of MCF- 7 cells(n=3)

2.3 戊地昔布對凋亡蛋白影響

給予戊地昔布(200 μmol/L)后，Bax蛋白表達升高，Bcl- 2蛋白表達降低，caspase- 3表達先升高，然后降解為cleaved-caspase- 3。對照組細胞基本檢測不到cleaved-caspase- 3表達(P<0.05或P<0.01)(圖3)。

2.4 戊地昔布對線粒體膜電位影響

膜電位較高時，JC- 1呈紅色熒光；膜電位較低時，JC- 1呈綠色熒光。對照組可見明顯的紅色熒光，給予戊地昔布后，可見紅色熒光減弱，綠色熒光增強(P<0.01)(圖4)。

A,B.the apoptosis was detected by flow cytometry; C.the apoptosis was detected by hoechst 33258 dye; *P<0.01 compared with control

*P<0.05，**P<0.01 compared with control

A.representative confocal laser images of mitochondrial transmembrane potential; B.quantitative analysis of the level of mitochondrial transmembrane potential;*P<0.01 compared with control

圖4 戊地昔布對MCF- 7細胞線粒體膜電位的影響

Fig 4 The effect of valdecoxib on mitochondrion transmembrane potential(×200)

2.5 戊地昔布對細胞ROS影響

對照組細胞熒光很微弱，給予戊地昔布后可見熒光明顯增強，抗氧化劑NAC可降低ROS水平(P< 0.01)(圖5)。

2.6 NAC，Ac-DEVD-CHO，Z-VAD-FMK對戊地昔布作用影響

抗氧化劑NAC、caspase 3 抑制劑Ac-DEVD-CHO和caspase抑制劑Z-VAD-FMK均可拮抗戊地昔布的抗腫瘤作用，這提示ROS和caspase途徑參與了戊地昔布抑制細胞增殖的作用(P<0.05或0.01)。NAC可拮抗戊地昔布誘導的凋亡(P<0.01)(圖6)。

3 討論

許多抗腫瘤藥物可通過多種方式誘導腫瘤細胞凋亡[4- 5]。本實驗結果顯示，戊地昔布可降低線粒體膜電位，誘導MCF- 7細胞的凋亡。線粒體膜電位的降低可增強線粒體通透性，進而激活caspase- 9和3，活化的caspase可引起DNA的斷裂、染色質濃縮，出現凋亡特有的形態學表現[6- 7]。戊地昔布可明顯增高caspase- 3表達，隨后caspase- 3降解為cleaved caspase- 3， caspase- 3抑制劑和caspase抑制劑可拮抗戊地昔布的生長抑制作用，這提示caspase的激活參與了戊地昔布誘導的細胞凋亡。Bcl- 2存在于線粒體外膜，可維持線粒體膜電位，延緩細胞的凋亡。Bax可引起細胞凋亡，這一作用可被Bcl- 2抑制[7]。本實驗結果表明，戊地昔布可引起Bcl- 2表達降低和Bax表達增高。

A.representative confocal laser images of ROS; B.quantitative analysis of the level of ROS;*P<0.01 compared with control;#P<0.01 compared with valdecoxib group

圖5 戊地昔布對細胞ROS的影響

Fig 5 The effect of valdecoxib on ROS of MCF- 7 cells(×200)

A.quantitative analysis of the antagonistic effect NAC, Ac-DEVE-CHO and Z-CAD-FMK on valdecoxibby MTT assay; B.representative flow acytometry images of apoptosis; C.quantitative anolysis of the effect of NAC on the apoptosis induced by valdecoxib;*P<0.05,**P<0.01 compared with valdecoxib group

圖6 NAC, Ac-DEVD-CHO和Z-VAD-FMK對戊地昔布抗腫瘤作用的影響

Fig 6 The growth inhibition effect of valdecoxib was antagonized by NAC, Ac-DEVD-CHO, and Z-VAD-FMK(n=6)

在藥物引起腫瘤細胞凋亡中，ROS的作用受到了廣泛關注。正常情況下細胞內ROS維持在穩定的范圍內，腫瘤細胞的抗氧化酶活性低于正常細胞，清除ROS的能力較正常細胞低，而腫瘤細胞產生的ROS又往往高于正常細胞，因此腫瘤細胞對ROS很敏感[8]。細胞內ROS的聚集是一個雙刃劍，ROS的輕度升高可促進細胞增殖，而高水平的ROS可介導Bax的活化，促進細胞凋亡或壞死[8]。很多抗腫瘤藥物如順鉑、醌類藥物等誘導的腫瘤細胞凋亡都與誘發ROS的產生相關[9- 10]。本實驗中，戊地昔布可誘發ROS明顯升高，抗氧化劑N-乙酰基半胱氨酸可拮抗戊地昔布的作用。這提示，ROS的升高參與了戊地昔布誘導的凋亡。線粒體是ROS產生和攻擊的主要部位，線粒體膜受到ROS攻擊后可發生脂質過氧化、通透性增高，caspase- 3的活化，進而引起細胞凋亡[10]。因此，本實驗檢測到的線粒體膜電位的降低可能是ROS增多，細胞氧化還原狀態平衡改變的結果。

綜上所述，戊地昔布可誘導人乳腺癌MCF- 7細胞的凋亡，與戊地昔布升高細胞內ROS，進一步激活caspase- 3，降低Bcl- 2的表達和增高Bax表達等有關。

[1] Ghosh N, Chaki R, Mandal V,etal. COX- 2 as a target for cancer chemotherapy[J]. Pharmacol Rep, 2010, 62:233- 244.

[2] Vurusaner B, Poli G, Basaga H. Tumor suppressor genes and ROS: complex networks of interactions[J]. Free Radic Biol Med, 2012, 52:7- 18.

[3] 徐清華，候曉敏，王慧慈，等.戊地昔布聯用吡柔吡星對人肺癌A549細胞凋亡的影響[J]. 中國藥學雜志, 2013, 48：972- 975.

[4] 紀春梅，甄永占，范曉禹，等.賴氨大黃酸與順鉑聯合對人肺癌A549 細胞系增殖和凋亡的影響[J].基礎醫學與臨床, 2014, 34: 155- 159.

[5] Mayora A, Arvelo F. Prostate cancer and apoptosis[J]. Invest Clin, 2011, 52: 376- 396.

[6] Frejlich E, Rudno-Rudzińska J, Janiszewski K,etal. Caspases and their role in gastric cancer[J]. Adv Clin Exp Med, 2013, 22: 593- 602.

[7] Kang MH, Reynolds CP. Bcl- 2 inhibitors: targeting mitochondrial apoptotic pathways in cancer therapy[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15: 1126- 1132.

[8] Sosa V, Moliné T, Somoza R,etal. Oxidative stress and cancer: an overview[J]. Ageing Res Rev, 2013, 12: 376- 390.

[9] 易健，舒徐.活性氧對細胞凋亡和增殖的調控作用[J]. 基礎醫學與臨床, 2013, 33: 1127- 1130.

[10] Wang HC, Choudhary S. Reactive oxygen species-mediated therapeutic control of bladder cancer[J]. Nat Rev Urol, 2011, 8: 608- 616.

Valdecoxib induces apoptosis of human breast cancer MCF- 7 cells by increasing ROS

ZHANG Man-li1,4, WANG Hui-ci1, LIU Jin-jin1, YU Ding2, WANG Zi-wei3, WU Jia-xin3, LI Jun-xia1*

( 1.Dept. of Pharmacology; 2.Dept. of Cardiac Surgery, the Second Hospital; 3.the Clinical Medicine of Seven-year Education, Hebei Medical University， Shijiazhuang 050000；4.Dept. of Thyroid and Breast Surgery, Cangzhou People’s Hospital, Cangzhou 061000，China)

Objective To study the role of ROS in the apoptosis of human breast cancer MCF- 7 cells induced by valdecoxib, a selective COX- 2 inhibitor. Methods MTT assay was used to observe the effect of valdecoxib on cell proliferation; Flow cytometry and hoechst 33258 dye were used to detect apoptosis; Laser confocal microscopy was used to detect the level of ROS and mitochondrial transmembrane potential; Western blot was used to detect the protein expression. Results 1)Valdecoxib significantly inhibited the proliferation of MCF- 7 cells(P<0.05 or 0.01)and induced apoptosis of the cells(P<0.01). 2)The expression of Bax was increased, and the expression of Bcl- 2 was decreased after valdecoxib was aplied. The expression of caspase- 3 was increased at first and then degradated into cleaved caspase- 3. Caspase- 3 inhibitor Ac-DEVD-CHO, and caspase inhibitor Z-VAD-FMK antagonized the growth inhibition effect of valdecoxib(P<0.05 or 0.01). 3)Valdecoxib significantly decreased the mitochondrial transmembrane potential, and increased the level of ROS. Antioxidant NAC antagonized the growth inhibition effect of valdecoxib(P< 0.01). Conclusions Valdecoxib induces apoptosis of MCF- 7 cells by enhancing the level of ROS.

valdecoxib; cyclooxygenase- 2; human breast cancer MCF- 7 cells; apoptosis; reactive oxygen species

2014- 09- 22

2015- 01- 04

河北省科技攻關項目(07276403D)；河北省衛生廳醫學重點課題(2008067)

1001-6325(2015)04-0491-05

R739.9

A

*通信作者(corresponding author)：lyjunxia@aliyun.com