異氟醚對老年大鼠空間學習記憶能力及海馬RhoA蛋白表達的影響

張文超 王庚 胡中華 段開明 歐陽文

[摘要] 目的 探討異氟醚吸入麻醉對老年大鼠海馬CA3區RhoA蛋白表達及空間學習記憶能力的影響。 方法 篩選出30只健康22月齡SD大鼠，隨機分為對照組C組（n = 10）、麻醉組Ⅰ組（n = 10）和Ⅱ組（n = 10）。麻醉組以3%的異氟醚誘導，采用經口明視氣管插管建立老年大鼠吸入麻醉模型，并以2%異氟醚維持麻醉2 h。C組大鼠不給任何麻醉藥，只置于麻醉箱中吸入氧氣2 h，氧流量為2 L/min。Ⅰ、Ⅱ組分別于麻醉后24、72 h進行曠場實驗和Y-迷宮實驗并計算成績。比較三組大鼠學習記憶能力，并采用免疫組織化學法檢測三組海馬區RhoA蛋白表達。 結果 ①Y-迷宮實驗：Ⅰ組的Y-迷宮學習次數[（70.50±16.25）次]明顯多于Ⅱ組[（61.80±23.49）次]和C組[（49.20±8.56）次]（P < 0.05），C組與Ⅱ組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。曠場實驗：三組的中央格停留時間、直立次數、跨格次數、總活動量次數比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。②免疫組織化學法：Ⅰ組海馬CA3區RhoA陽性細胞計數（112.66±11.56）多于Ⅱ組（97.77±7.47）與C組（99.33±12.10）（P < 0.05），Ⅱ組與C組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 22月齡SD大鼠接受異氟醚麻醉后24 h空間學習記憶能力下降，于麻醉后72 h基本恢復，異氟醚麻醉后大鼠海馬區Rho蛋白家族信號傳導分子變化介導的神經突觸形態學改變可能是短期空間學習記憶能力損傷的細胞學基礎。

[關鍵詞] 異氟醚；Y-迷宮；老年大鼠；RhoGTPases；RhoA

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（a）-0038-04

Affect of Isoflurane on spatial memory function and hippocampal RhoA expression in aged rats

ZHANG Wenchao1 WANG Geng1 HU Zhonghua2 DUAN Kaiming2 OUYANG Wen2▲

1.Department of Anesthesiology， Beijing Jishuitan Hospital， Beijing 100035， China； 2.Department of Anesthesiology， the Third Xiangya Hospital of Central South University， Hu'nan Province， Changsha 410083， China

[Abstract] Objective To study affect of Isoflurane with inhalation anesthesia on hippocampal RhoA expression and spatial memory function in aged rats. Methods Thirty 22-month-old Sprague-Dawley rats were randomly assigned to control group （group C， 10 cases）， anesthesia group Ⅰ （10 cases） and anesthesia group Ⅱ （10 cases）. The inhalation anesthesia model of aged rat was established by using endotracheal intubation， 2% Isoflurane was applied to maintain anesthesia of 2 hours after anesthesia induction with 3% Isoflurane by inhalation in anesthesia groups. Any drug was not used in rat of group C， which inhaled 100% oxygen for 2 hours， oxygen flow rate was 2 L/min. Open-field experiment and Y-maze experiment were implemented， performance was calculated after anesthesia of 24， 72 hours in group Ⅰ and group Ⅱ. Learning and memory ability in rats of three groups were compared. Hippocampal RhoA expression in rats of three groups were detected by using the immune histochemical method. Results ①Y-maze experiment： Y-maze learning time of group Ⅰ [（70.50±16.25） times] was significantly more than that of group Ⅱ [（61.80±23.49） times] and group C [（49.20±8.56） times] respectively （P < 0.05）. Y-maze learning time of group C and group Ⅱ was compared， with no statistical difference （P > 0.05）. Open-field experiment： there were no statistical difference on the middle of residence time， number of upright， number of across grid， number of total activity among three groups （P > 0.05）. ②Immune histochemical method： RhoA positive cell count of hippocampal CA3 area in group Ⅰ （112.66±11.56） was more than that in group Ⅱ （97.77±7.47） and group C （99.33±12.10） respectively （P < 0.05）. RhoA positive cell count of hippocampal CA3 area in group Ⅱ and group C was compared， with no statistical difference （P > 0.05）. Conclusion Spatial learning and memory ability of 22-month Sprague-Dawley rats received Isoflurane anesthesia of 24 hours decline， basic recovery after anesthesia of 72 hours. The hippocampus of rat after Isoflurane anesthesia Rho protein signal transduction molecular change mediated synaptic morphology change may be the cellular basis of short-term spatial learning and memory damage.

[Key words] Isoflurane； Y-maze； Aged rat； RhoGTPases； RhoA

近年來，許多研究從大腦海馬區神經突觸形態學的變化來探究神經結構對學習記憶功能的影響。異氟醚對神經軸突與樹突結構有很大的可塑性，而這種可塑性的變化可能是學習與記憶能力的細胞基礎[1]。Rho蛋白家族是與受體偶聯的小G蛋白家族，分子量為20～30 kD，屬于Ras超家族成員，在細胞內信號傳導中具有重要的功能[2]。其主要成員RhoA蛋白調節細胞肌動蛋白骨架的聚合，對神經纖維延長與塌陷、神經生長方向具有導向作用，通過對肌動蛋白的調控而起調控樹突狀偽足和樹突棘形態的動態變化，影響神經可塑性，而這一現象在學習基本形式的長時程增強（LTP）中有充分的體現[3]。本研究以老齡SD大鼠作為研究對象，通過建立吸入麻醉模型，使用動物行為學實驗觀察異氟醚麻醉后老年大鼠興奮性、探索性指標以及空間辨別能力的變化，通過免疫組織化學方法觀察大鼠海馬區RhoA蛋白的表達變化，為探討22月齡大鼠短時間異氟醚麻醉后興奮性、空間辨別能力改變的的機制提供理論依據，從而更好地闡明吸入異氟醚后對認知功能障礙的發病機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組

22月齡老齡SD大鼠，訂購于湖南農業大學動物科技學院實驗動物養殖場（生產許可證SCXK湘2006-0001）體重550～620 g。飼養條件為（22±1）℃，相對濕度40%～50%，自然晝夜非直接光照。經穿梭箱回避實驗篩選出30只學習記憶能力正常的大鼠，隨機分為對照組C組（n = 10）、麻醉后24 h Ⅰ組（n = 10）和麻醉后72 h Ⅱ組（n = 10）。

1.2 模型建立

采用Deatex-Ohmeda氣體監測儀監測自制麻醉箱中異氟醚濃度。待麻醉箱內異氟醚濃度調節至3%時將麻醉組大鼠放于麻醉箱內5 min，再將處于誘導狀態的老年大鼠，置于自制拱形氣管插管臺上，采用經口明視氣管插管方法，將14G靜脈套管經鋼絲引導插入老鼠氣管中[4]。PetCO2探頭確定氣管插管操作成功后，將氣管導管與麻醉機相連，大鼠自主吸入麻醉氣體，異氟醚濃度調為2%。應用鼠尾無創血壓檢測儀與分析系統（北京中西遠大科技有限公司）于麻醉誘導前，麻醉誘導過程中，麻醉維持2 h與蘇醒后分別檢測大鼠鼠尾無創收縮壓、舒張壓、平均動脈壓（MAP）、心率（HR）。麻醉結束后，大鼠在吸入純氧下自然蘇醒。

1.3 行為學實驗方法

1.3.1 Y-迷宮實驗

根據文獻[5]，將大鼠放入Y-迷宮箱中適應3～5 min，然后隨機開始實驗：隨機變換電擊區和安全區，觀察動物學會逃離電擊區而進入安全區的反應能力。大鼠進入安全區后，燈光繼續維持5 s，以便大鼠確認安全位置。兩次測試時間間隔為30 s，每次訓練20次，休息5 min，連續測試直到學會為止，若測試次數﹥100次則不再測試，并以100為最大計數值。每次測試后，清理Y-迷宮箱，以免動物氣味對下次測試結果造成影響[6]。

1.3.2 曠場實驗

參照文獻[7-8]采用自制曠場實驗觀察箱100 cm×100 cm×50 cm（長×寬×高），箱底分為25個方格（20 cm×20 cm），墻壁涂黑。將曠場分析箱從左上開始，按左到右順序以不同編號為相同的25個小格，其中7、8、9、12、13、14、17、18和19為中央區域，其余為外周格，13號為中央格子。每次實驗時捏住大鼠尾巴距根部2/3處輕放入中央格中，觀察大鼠5 min內活動情況，每次測定結束將動物排泄物清除干凈，每只僅測定1次。實驗時間結束錄像分析結果。設兩位觀察者分別觀察記錄不同指標。以跨格次數為水平活動得分，直立次數為垂直活動得分，記錄中央格停留時間。

1.4 標本制備

行為學測試后，用麻醉致死法對大鼠腹腔注射麻醉藥，在大鼠心臟還在跳動時通過左心耳快速灌注4℃生理鹽水100 mL洗凈血液，然后以4%多聚甲醛200～300 mL灌注固定。止血鉗剝離大鼠顱骨，取出完整大腦置于4℃ 4%多聚甲醛中浸泡6 h，而后移入4℃的30%蔗糖溶液，將大腦冰凍切片（片厚為30 μm），用pH 7.4的0.01% PBS切片，接著進行免疫組織化學染色。

免疫組織化學染色：切片移入0.1Triton～0.001% H2O2溶液中，在37℃下反應30 min，PBS緩沖液漂洗后，以3%正常羊血清封閉30 min，然后加兔抗RhoA抗體，4℃溫盒內孵育72 h。漂洗后加入即用型二抗（上海長島生物技術有限公司），37℃孵育30 min，PBS沖洗，0.05% DAB～0.01% H2O2溶液顯色，脫水，封片。應用彩色病理圖片分析系統，對所有切片在同一光度下，每張切片隨機選取3個200倍鏡下視野計數陽性細胞，以單個標本為單位，取平均值。

1.5 RhoA分析

參照大鼠腦圖譜，每只大鼠選含背側海馬相應斷面，選擇其中顯色較好且非特異性背景染色控制良好的切片3張。在光鏡下從每張切片的海馬CA3區有代表性區域分別隨機選擇3個高倍視野（10×40倍），統計各視野RhoA陽性細胞數。陽性標準：棕黃色顆粒，特異性分布于胞質與胞核。染色深度達到足以區分細胞周界的神經元被計數，計算平均值。同時分別在20倍與400倍鏡下采集圖像，通過圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0對切片免疫組織化學陽性染色細胞進行定量分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

三組22月齡大鼠體重無統計學意義（P > 0.05）。麻醉組老齡SD大鼠中麻醉前后收縮壓、舒張壓、MAP、HR、鼠尾氧飽和度保持在正常范圍，PetCO2維持在36～42 mm Hg（1 mm Hg = 0.133 kPa）且波形規則，皮膚顏色紅潤，未出現血壓較大波動及缺氧現象。

2.2 三組大鼠行為學實驗結果比較

曠場實驗：三組大鼠跨格次數、直立次數、總活動量次數及中央格停留時間比較，差異均無統計學意義（均P> 0.05）；Y-迷宮實驗：Ⅰ組Y-迷宮學習次數明顯多于Ⅱ組和C組（P < 0.05），而Ⅱ組與C組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

表1 三組大鼠行為學實驗結果比較（x±s）

注：與Ⅰ組比較，*P < 0.05

2.3 三組大鼠免疫組織化學反應結果

光鏡下免疫組織化學結構顯示：大鼠海馬組織中可見RhoA主要分布于椎體細胞層和輻射層，陽性細胞呈棕褐色，染色均勻，排列規則，呈弧形分布。200倍鏡下隨機選取3個視野大鼠海馬區RhoA陽性細胞計數，Ⅰ組RhoA陽性細胞計數多于Ⅱ組和C組（P < 0.05），Ⅱ組與C組比較差異無統計學意義（P > 0.05），表明在異氟醚吸入麻醉后24 h，大鼠海馬區RhoA表達增加，吸入麻醉后72 h有所恢復。見表2。

表2 三組大鼠海馬CA3區RhoA陽性細胞計數比較

注：與Ⅰ組比較，*P < 0.05

3 討論

術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是指麻醉術后老年患者性格改變、學習記憶能力下降等中樞神經系統功能障礙[9-11]。作為老年患者術后常見并發癥給患者術后生活帶來嚴重煩惱，導致患者喪失社會活動、工作學習以及生活自理能力，因此減少麻醉術后認知障礙發生具有非常重要的意義。調查顯示，盡管醫療技術水平有了很大提高，但是對于POCD發病機制以及預防和治療方法未得到顯著改善。鑒于中樞神經系統和認知相關研究的復雜性，POCD發生、發展的機制一直沒有得到圓滿解答。突觸是一個神經元的沖動傳到另一個神經元或傳到另一個細胞間相互接觸的結構，是神經元之間在功能上發生聯系的部位，也是信息傳遞的關鍵部位。神經軸突與樹突結構有很大的可塑性，而這種可塑性的變化可能是學習與記憶能力的細胞學基礎[12]。

在動物實驗中，主要采用行為學實驗研究藥物對動物學習記憶能力的影響，人和動物的內部心理過程很難直觀觀察到，通過客觀的動物實驗模型來間接推測腦內所發生的過程，從而反映動物認知能力的水平與變化[13]。目前，國內外多采用建立條件反射方法檢測動物的行為能力和高級腦功能。曠場實驗是將一定面積劃分為不同區域，并以相應的格子對應。大鼠在新環境中是由緊張、興奮、探索再到適應的一系列過程，興奮性的老鼠在適應的環境中表現為行動活躍，四處走動，留下自身的生物氣息，跨格次數的多少反映其興奮程度?？绺翊螖档亩嗌倥c動物的行動量成正比，跨格次數多，活動的距離也相應增加，這些觀察指標可以間接地反映動物中樞神經系統的興奮或抑制狀態。實驗中，三組大鼠中央格停留時間、跨格次數、直立次數、總活動量次數差異無統計學意義，表明2%異氟醚麻醉后24、72 h對大鼠的緊張、興奮、探索等興奮性指標沒有顯著變化，因此可以認為短時間吸入異氟醚對老年大鼠的空間學習能力影響不是由于其中樞興奮狀態的改變而產生的。Y-迷宮用于檢測大鼠的空間辨別能力，老年大鼠在迷宮中對電刺激和光刺激出現被動的逃避反應，經過多次訓練后大鼠就能學會并記住迷宮的安全位置，間接地反映出老年大鼠的學習記憶能力[14]。Y-迷宮達到學會標準的次數能夠較客觀地表現大鼠的學習能力。

多年來，海馬一直被認為是參與學習記憶的重要腦區，因海馬是大腦邊緣系統的重要組成部分，參與外界信息中樞傳遞的整合，一直是神經科學領域研究的焦點，海馬區突觸結構與大鼠學習記憶能力密切相關。海馬區神經元在學習記憶過程中主要參與學習記憶鞏固的早期過程[15-16]，而后期的學習記憶過程更多是與其他腦區有關[17]。本實驗結果表明，Ⅰ組大鼠達到學會標準所需的訓練次數明顯多于對照組（C組），差異有統計學意義（P < 0.05），Ⅱ組與C組之間差異無統計學意義，表明2%異氟醚麻醉2 h后可導致老年大鼠空間學習能力受損，學習能力下降，這種現狀在麻醉后第1天表現最為明顯，而第3天基本恢復，學習結果體現在海馬區神經突觸結構的變化基礎上，通過免疫組織化學法可以直觀觀察海馬區RhoA陽性細胞的變化與學習成績變化趨勢相同，因此可以推斷異氟醚麻醉后老年大鼠短期內認知能力受損與異氟醚麻醉對海馬CA3區RhoA表達的影響干擾了突觸偽足的形成與塌陷有關。Kaech等[18]為觀察全麻藥物對突觸的影響，使用熒光顯微鏡實時拍攝技術，觀察樹突棘的形態變化，結果發現，在培養液中加入異氟醚后，神經細胞樹突棘活力下降，說明吸入麻醉藥會影響海馬區樹突棘的動力性和棘突結構的改變。神經軸突與樹突應對麻醉刺激有很大的可塑性，而這種形態學的變化可能是學習與記憶能力改變的細胞基礎[19-20]。RhoA通過影響肌球蛋白收縮引起軸突生長錐的回縮及塌陷，RhoA主要通過Rho相關激酶信號傳導通路調節肌動蛋白微絲骨架的聚集，進而影響細胞的極性和形態，RhoA可使多個氨基酸位點磷酸化而激活，肌球蛋白磷酸酶結合亞單位是活化Rho相關激酶的底物，磷酸化失活后，促使肌動蛋白微絲骨架聚合，從而影響細胞收縮[21]。本實驗通過觀察老年大鼠海馬組織中Rho蛋白家族RhoA表達變化，試圖從異氟醚對海馬組織中神經突觸間信號傳導分子變化的角度來闡釋麻醉后學習空間能力的改變。實驗中觀察到麻醉后大鼠海馬組織中RhoA表達增高，麻醉后72 h恢復正常水平，說明異氟醚吸入麻醉后，大鼠海馬區神經元處于活躍狀態。麻醉24 h后RhoA表達增加，說明RhoA介導的突觸塌陷占主要地位，新的神經突觸的建立處于抑制狀態，麻醉72 h后表達有所恢復，說明新的突觸生長已經恢復到麻醉前水平，而突觸的塌陷可能是神經細胞重塑的表現。異氟醚麻醉后老年大鼠短期內認知能力受損，很可能是由于異氟醚麻醉對RhoA表達的影響干擾了突觸偽足的形成與塌陷。神經形態學的變化與神經傳導功能具有重要的相關性，異氟醚影響海馬區Rho蛋白家族信號傳導分子變化所介導的神經突觸形態學改變很可能是學習記憶能力的細胞學基礎。

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（收稿日期：2015-03-05 本文編輯：李亞聰）