中藥微生物轉化的研究

吳 思

（湖北職業技術學院，湖北 孝感 432100）

微生物轉化中藥是指利用微生物產生的酶系作用于中藥底物,以期產生新的活性成分,提高中藥藥效,降低中藥不良反應,去除中藥中的大分子雜質和將其作為研究藥物代謝機制的輔助手段。由于其具有周期短、成本低、區域和立體選擇性強、反應條件容易控制、對周圍環境影響小等特點,且能夠產生一些化學法難以生成的產物,因此近年來,微生物轉化方法已經受到研究者的廣泛重視,并正迅速地發展。通過先導化合物經生物轉化方法尋找新的高活性、低毒性的藥物已成為有效開發新藥的一條途徑。

微生物轉化中藥的本質是利用微生物體系產生的酶對外源性中藥底物進行結構轉化的生物化學過程[1]。微生物轉化中藥具有以下特點：(1)微生物轉化酶系廣泛。微生物在生長過程中會產生多樣的酶系,如纖維素酶、木質素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶等,目前已發現了3000余種能催化各種化學反應的酶[2]。微生物豐富而強大的酶系構成了高效生物催化體系的核心,且微生物的酶系所催化的反應很多是一些化學合成難以進行的反應。(2)反應選擇性強。具體來講主要包括化學選擇性、非對映異構體選擇性、區域選擇性、面選擇性、對映異構體選擇性以及立體選擇性[3],同時微生物轉化修飾中藥底物某一基團時對不需要轉化的基團無需保護,顯示出極高的選擇性。(3)反應條件溫和。由微生物所介導的轉化反應一般都在常溫、常壓下進行,運行操作的設備也比較簡便,產生的公害少,一般不造成環境污染,后處理也很簡單。中藥底物在轉化過程中可以最大限度地保護中藥中活性成分免遭破壞,可有效解決中藥在煎、煮、蒸、浸等傳統工藝中活性成分難以最大限度提取的難題。(4)優化條件可使轉化率提高。微生物轉化中藥底物的過程中易受到底物溶解度低,底物和產物抑制微生物酶活性和產物進一步降解等影響。為了提高轉化率,可以從誘導物和底物的添加,表面活性劑的添加,碳源、氮源、無機鹽,微量元素和酶的抑制劑以及微生物細胞和酶的固定化,反應體系等方面進行選擇優化。此外,微生物轉化中藥的反應可以被看作微生物發酵過程,所以可以連續進行。同時由于設備和原料簡單易得,生產成本較低,可進行工業化規模生產。

很多菌種都能使多種化合物發生不同的反應,這些菌種主要是霉菌、酵母菌和細菌,其中又以霉菌在文獻中特別常見。微生物轉化主要涉及了羥基化、環氧化、脫氫、加氫、水解、酯化、脫水等各類化學反應,還有些代謝產物在轉化過程中發生了很復雜的化學反應,人們可以通過這些反應尋找新的有藥用價值的衍生物,也可以尋找使這些反應發生的微生物的酶,進而用于工業化生產。本文將從微生物轉化的反應類型展開討論，闡述微生物對中藥的生物轉化作用。

1 羥基化

20世紀50年代首次用黑根霉 (Rhizopus nigricans)將黃體酮轉化為11α-羥基黃體酮,使人們開始意識到微生物轉化在制藥工業中的重要性,從此微生物轉化技術在藥物工業生產中成為不可或缺的一種方法。羥基化是微生物轉化中最常見也最重要的一種反應,羥基化反應可以發生在多個位置,生成多種有意義的衍生物。尤其是甾體藥物,特別是α位的羥基化產物,在甾體制藥工業中發揮著重要作用。比如甾體的7α-羥基化衍生物可以用于利尿劑的生產,但用化學方法合成很困難,文獻[4]報道利用菌種Botrytis cinerea使睪丸激素等幾種甾體化合物生成7α-羥基衍生物,研究發現在不同孵化期轉化的甾體化合物不同，經過5天的孵化主要代謝物是第7α-hydroxytestosterone（76%收益率），經過6天的孵化主要代謝物是7α-羥基-17α-甲基睪酮（82%收益率），經過6天（以及孵化后10天）的主要代謝產物是10β-羥基-19-去甲雄基-4-烯-3,17-二酮（78%收益率），經過10天的孵化轉化的主要產品是14α-羥基-1-脫氫睪酮（68%收益率），經過11天的孵化轉化的主要產品是7α-羥基-1-脫氫-17α-甲睪酮（52%收益率），可以看出，菌種Botrytis cinerea能夠非常有效地使睪丸激素等幾種甾體化合物生成7α-羥基衍生物，而且產量很高。

不僅是甾體化合物,其他化合物的羥基化代謝產物同樣具有重要的應用意義。如ent-kaur 16-en-19-oic acid,一種二萜類化合物,具有刺激植物生長的活性。利用菌種Rhizopus stolonifer轉化此化合物,7d后產生2種代謝產物,其中一種產物也是7α位發生羥基化,該產物可以作為赤霉素生物合成和一種植物生長激素的中間體。

2 脫氫反應

脫氫反應,一般主要是指化合物脫氫生成雙鍵。氯化孕酮醋酸酯(chlormadinone acetate),一種治療前列腺疾病的抗雄性激素藥品,文獻[5]用Arthrobacter simplex和Bacillus sphaericus這2種菌使其發生了脫氫反應生成雙鍵,反應所得產物為脫氫氯化孕酮醋酸酯(delmadinone acetate),這種產物不但和氯化孕酮醋酸酯一樣,是治療前列腺疾病的抗雄性激素藥品,還是合成乙酰環丙氯地孕酮(cyproterone acetate)的前體,而乙酰環丙氯地孕酮因為有抗雄性激素的活性而被廣泛的用作孕激素藥品,它可以避孕和治療前列腺癌。文中研究了利用單節桿菌

ATCC 6946和球形芽孢桿菌ATCC 13805自由和固定化細胞在液液兩相體系和脂質體中對氯地孕酮醋酸酯的微生物轉化。對于液液兩相體系，正癸烷，正辛醇，氯仿和醋酸丁酯作為有機溶劑。脂質體由氯地孕酮醋酸包埋在磷脂和膽固醇的脂質體組成。對于這兩種生物催化劑固定化和自由懸浮，產量在水溶液中高于在液液兩相媒體。在所有情況下，水系統獲得的產量最高。在水介質中，從單節桿菌懸浮液中3小時可以獲得48%的產率，從球形芽孢桿菌懸浮液中48小時可以獲得47%的產率。除了脫氫生成雙鍵,還有實驗發現[6],利用Rhodococcus erythropolis DCL14可以使香芹醇脫氫生成香芹酮。

3 支鏈的降解

利用微生物選擇性的使支鏈降解,可以得到有用的化合物中間體,這也是生物轉化在制藥及其他化工工業生產中的一大用處,具有非常廣闊的應用前景。雄甾-4-烯-3,17-二酮 (4-AD)和雄甾1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)就是生產性激素等甾體藥物的重要中間體,利用菌種Mycobacterium sp.NRRL B-3683[7]即可將膽固醇側鏈降解生成這2種化合物。文獻[8]同樣都以氫化可的松作底物,用不同菌種卻得到相似的結果,2個實驗都出現了支鏈降解產物。文獻[9]的實驗中得到的2種支鏈降解產物,一種與文獻[8]得到的產物相同,而另一種則是前者產物的17位羥基變成了酮基。如果這2個菌種都可以選擇性的降解氫化可的松類似物的支鏈,將可能找到更多的所需的中間體。

4 酯化反應和水解反應

桉烷型化合物大部分都含有乙酸酯結構,在代謝過程中,雖然所用的菌種不同,但幾乎所有的底物都產生了酯基水解的代謝產物。而與水解反應相對,作者也同樣發現乙酸酯化反應也比較容易出現在代謝產物中[10]。在酯化反應中,作者發現密葉辛木素(confertifolin),經過轉化后生成2種代謝產物,其中主產物是3β-羥基化密葉辛木素,而另一種代謝產物則是3β-乙酸酯化密葉辛木素。很有可能這兩個產物是由一條代謝途徑來完成的,這一推測可能為合成有用的酯類化合物提供了捷徑。

5 環氧化

環氧化反應在轉化的過程中也很普遍,多發生在化合物的雙鍵部位,尤其在萜類中常見,除環氧化反應,雙鍵部位也很容易形成鄰二醇結構,沒藥醇[11][(-)-α-bisabolol]一種單環倍半萜類化合物,它在Glomerella cingulata作用下生成的幾種代謝產物就是這一類反應的典型代表。還有前面提到的ent-kaur-16-en-19-oicacid,其在培養15 d后又出現一種代謝產物ent-16β,17-dihydroxy-kauran-19-oic acid,這個代謝過程發生的化學反應使16,17位雙鍵生成為鄰二醇結構。

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［5］Jiradej Manosroi,Pattana Sripalakit,Aranya Manosroi.Biotransformation of chlormadinone acetate to delmadinone acetate by free and immobilized Arthrobacter simplex ATCC 6946 and Bacillus sphaericus ATCC 13805 [J].Enzyme and Microbial Technology,2003,33：320-325.

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