贛州市唇腭裂孕婦血漿代謝組學的初步分析*

凌永昌　劉　翔　張　瑩　劉新征　李年生

贛州市唇腭裂孕婦血漿代謝組學的初步分析*

凌永昌①劉翔①張瑩①劉新征①李年生①

目的：探討唇腭裂孕婦血漿代謝組學特點，為臨床早期檢測唇腭裂胎兒提供診斷依據。方法：選取2014年2月-2015年4月本院產前超聲篩查診斷胎兒為唇腭裂的孕婦21例作為病例組，隨機選取同期本院產前篩查診斷胎兒為正常的孕婦21例作為對照組，采用基于核磁共振（NMR）的代謝組學技術分別檢測并比較兩組孕婦血漿代謝組學特點。結果：病例組血漿代謝產物與對照組有顯著差異，病例組患者血漿中苯丙氨酸、纈氨酸和酪氨酸含量高于對照組，而丙氨酸、膽堿、磷酰膽堿代謝產物較對照組含量降低。結論：基于NMR代謝組學技術可較好反映唇腭裂胎兒孕婦血漿代謝變化，能獲得相應特征代謝物，有重要臨床應用前景。

唇腭裂； 孕婦； 血漿； 代謝組學

First-author's address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.27.004

唇腭裂為常見先天性顏面部畸形疾病，在胚胎發育至6～12周時，外胚間質細胞不能正常增生、分化、凋零、退變，導致面（腭）突融合障礙而形成唇部和腭部裂隙，為顱面先天發育畸形之一，影響生活質量［1］。臨床中三維超聲在孕期對胎兒唇腭裂有早期診斷價值，但受羊水、胎兒體位及操作手法等影響，存在一定誤診、漏診率。代謝組學通過檢測機體生物標本，反映機體病理生理及基因改變，為近年來發展的新興技術，在臨床疾病診斷、病理學及中藥療效中有重要應用價值［2-3］。唇腭裂與多因素遺傳有相關性，且與孕期吸煙、用藥等因素有關［4-5］。本研究探究了基于NMR代謝組學技術在唇腭裂孕婦血漿代謝組學中的檢查效果，現具體報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選取2014年2月-2015年4月本院產前超聲篩查診斷胎兒為唇腭裂的孕婦21例作為病例組，隨機選取同期本院產前篩查診斷胎兒為正常的孕婦21例作為對照組。病例組年齡22～42歲，平均（29.8±4.2）歲；孕周17～29周，平均（22.4±3.4）周。對照組年齡21～41歲，平均（29.6±4.1）歲；孕周18～31周，平均（22.5±3.6）周。兩組年齡、孕周等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2入組標準 （1）病例組孕婦產前經超聲檢查胎兒明確診斷為唇腭裂，排除合并妊娠疾病的孕婦和胎兒；（2）排除孕婦家屬患有Robbin綜合征者或Shprintzen綜合征等綜合征性唇腭裂的孕婦；（3）排除合并有先天性代謝缺陷疾病的孕婦；（4）排除有血液系統疾病或臨床生化結果異常者；（5）排除合并有傳染病如肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征等的患者。

1.3方法

1.3.1血漿樣本采集 所有研究對象空腹6 h以上后次日清晨抽取空腹靜脈血送檢驗科檢查。抽取全血4 mL置入一次性靜脈采血器抗凝管中，以1500 r/min速度離心15 min，后取2 mL上清液置入去酶EP管內，采用渦旋混勻器快速混勻1 min，在4 ℃溫度下以14 000 r/min速度離心15 min，取1.5 mL上清液置入EP管內，并立即存入-20 ℃低溫冰箱中待用。

1.3.2樣本預處理 室溫下解凍樣本，將EP管依次編號，分別在關內加入600 μL樣本液和300 μL重水，以快速渦旋混勻器震蕩混勻30 s后靜置10 min，在4 ℃溫度下以14 000 r/min轉速離心5 min，取上清液500 μL加入直徑為5 mm核磁共振管中，待NMR分析。

1.3.3圖譜和數據處理與獲得 采用NMR方法分析，測量儀器采用INOVA-400MHZ型超導核磁共振波譜儀，獲得兩組患者血漿一維1H NMR譜圖。在室溫條件下，在NMR波譜儀上調整Presat脈沖序列，調整脈沖為45。，用預飽和方式抑制水峰，調整觀測頻率為399.89 Hz，弛豫時間為1 s，預飽和時間為2 s，譜寬5218.2 Hz，采樣點數64 k，采樣時間為3.744 s，疊加次數128次，儀器的分辨率為0.45 Hz，靈敏度為450∶1，預飽和頻率和中心頻率為水峰位置。獲取樣本的波譜圖，即原始自由感應衰減信號數據。將所有樣本的NMR數據導入MESTRE-v4.7軟件中進行分析，調節FID信號32 k傅立葉變換后，獲取1H NMR圖譜。將定位TMS峰為δ0.00，對所獲圖譜進行基線和相位校正后，確定NMR譜化學位移，對δ0～4.52、δ6～10區域譜峰者，每段按照Δ6=0.04 ppm將譜圖分解成212個區域，后進行分段積分，獲得各個化學位移值段所對應積分值。光譜采集所有樣本，獲得血漿數據，并將其構成n x d二維矩陣。將積分數據統一后，用Excel或文本方式儲存。采用SIMCA-P11.0軟件對PCA進行分析，求出主成分，血漿的代謝組成分采用PC進行分析。所得分析結果使用載荷圖和得分圖表示。載荷圖反映所有積分段對樣本主成分得分值貢獻，與得分圖進行結合分析獲得組間分布差異，并分析出此差異對積分段貢獻；結合1H NMR譜圖與所對應化學位移值進行對應后即可確定相應的代謝物，從而分析出樣品中某些代謝物的變化和其可能意義。得分圖通常采用各樣本在前2個主成分坐標系中的值來表示，反映樣本之間的分布關系，從中可以得出各組樣本之間的差異。通過對OPLS-DA進行分析，得出所有代謝物相應的相關系數，將有統計意義代謝物統一進行歸納。在相關系數圖中，將每一個變量的標準偏差的平方根值與loading值相乘后對數據進行回溯轉換。將轉化結果與相應相關系數臨界值表進行對比，獲得引起組間差異的代謝物。

2　結果

2.1兩組血漿1H NMR圖譜對照比較 將唇腭裂胎兒孕婦和正常胎兒孕婦血漿1H NMR核磁代謝圖譜放大16倍并進行疊加比較，波譜顯示兩組樣品在δ0.5～5.5 和δ5.5～9.0的化學位移處存在差異波峰，見圖1。

圖1　兩組血漿樣品1H NMR圖譜變化

2.2主成分分析 為分析各血漿樣本間關系，將校正后的數據做PCA分析。PCA是可以將分散在一組變量上的代謝圖譜信息集中到某幾個綜合指標上的統計分析方法，利用主成分分析機體代謝的變化特征。采用SIMCA-P+軟件（V11.0， Umetrics AB， Umea， Sweden）對歸一化后的數據進行模式識別多變量分析，PCA采用中心化換算（mean center scaling，Ctr）的數據標度換算方式，見圖2。

圖2　基于兩組血漿樣本1HMR圖譜主成分分析

2.3組間差異代謝物統計 病例組患者血漿中苯丙氨酸、纈氨酸和酪氨酸含量高于對照組，而丙氨酸、膽堿、磷酰膽堿代謝產物較對照組含量降低，見表1。

表1　兩組代謝產物差異統計

3　討論

唇腭裂為先天性發育畸形疾病，為母體及胎兒在受到多種影響因素下引起的發育畸形，對胎兒正常生長發育、生活、學習有重要影響。唇腭裂患兒出生后對其語言、聽覺、外觀及心理造成嚴重影響，可對健康、社會融合造成長期不良后果［6-8］。在妊娠過程中及時發現唇腭裂胎兒，早期進行干預可降低唇腭裂出生率，對提高生育質量有重要幫助［9］。臨床中尋找有效早期診斷標志至關重要，三維超聲為目前臨床中妊娠期診斷唇腭裂有效、經濟、無創、便捷的輔助手段，常規在妊娠16～27周進行檢查，通過直接觀察胎兒發育狀況判定是否患有唇腭裂［10］。但長期臨床實踐發現，超聲在檢查過程中胎兒位置變動、羊水過少、孕周過大或過小及超聲操縱人員手法不一等多種因素均可影響獲得胎兒面部滿意三維容積圖像，因此會造成誤診、漏診或診斷不清［11］。

代謝組學為新興技術是通過考察生物體系受刺激或擾動后（如某個特定的基因變異或環境變化后）其代謝產物本身的改變或隨時間的變化，來研究生物體系的代謝途徑的一種技術［12］。與基因組學、轉錄組學和蛋白質組學相對應，代謝組學是一門對某一生物或細胞所有低分子量代謝產物進行定性和定量分析，以監測活細胞中化學變化的科學［13］。代謝組學通過對某一生物或細胞所有低分子量代謝產物進行定量或定性分析，檢測機體體液、細胞提取物、細胞培養液及組織代謝物質變化，通過生物信息、化學計量學、統計學分析從而發現其內在聯系，發現在特定疾病中代謝組學特征，從而獲得診斷依據［14］。

唇腭裂發生受母體遺傳和環境影響，基于NMR代謝組學技術對生物液體檢測可達到正常生理水平，獲得具有特征代謝指紋圖譜，通過對比分析特征性代謝組學，為整體研究母體代謝在畸形發生過程中的變化提供了有效手段［15］。有研究提示，先天性唇腭裂患者和正常人的血漿代謝存在差異，運用代謝組學技術可以早期篩查唇腭裂疾病并探討其代謝機制，同時表明在此基礎上推斷其潛在的發病具有一定可行性［16-17］。本次研究將超聲明確診斷為唇腭裂孕婦血漿代謝組學與正常孕婦進行對比分析，結果得出兩者血漿代謝產物存在顯著差異，病例組患者血漿中苯丙氨酸、纈氨酸和酪氨酸含量高于對照組，而丙氨酸、膽堿、酰膽堿代謝產物較對照組含量降低。這些差異特征代謝產物可能為唇腭裂胎兒生物學標記，為以后臨床通過血漿代謝組學檢測診斷唇腭裂提供有效依據。苯丙氨酸和纈氨酸均為人體必須氨基酸，纈氨酸可作用于黃體、乳房、卵巢，維持神經系統發揮正常作用。苯丙氨酸主要作用于人體神經中樞，確保神經、體液等各項調節正常。丙氨酸為人體非必須氨基酸，但在人體中發揮重要作用，可協助機體將葡萄糖轉化為能量，同時還能協助人體肝臟對各種毒素進行清除，為機體提供大量能量。膽堿為有機堿，為卵磷脂合成主要成分，同時在神經鞘內廣泛存在，為人體甲基產物組成成分，同時為乙酰膽堿前體。研究指出，膽堿可促進人體機體、大腦發育，具有調控細胞凋亡、完成信息傳導、提高人體記憶力等功效［18］。唇腭裂患兒母體上述成分出現異常可能和疾病發生有一定相關性。有學者研究指出，在腭胚突發育過程中母體環境與胚胎環境是緊密相關的，胚胎代謝異常會引起母體代謝的異常變化，兩者之間存在有互動的關系［19］。表明唇腭裂胎兒代謝與母體有特定相關性，通過檢測孕婦血漿代謝組學，分析特有特征對臨床診斷妊娠期唇腭裂疾病有重要意義。

綜上所述，基于核磁共振的代謝組學技術可較好獲得妊娠唇腭裂孕婦血漿代謝產物，通過分析代謝組學特征可為臨床提供診斷唇腭裂的有效方法，在未來臨床中具有較廣泛的應用價值。

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Preliminary Analysis of Metabonomics of Pregnant Women with Cleft Lip and Palate Fetus in Ganzhou City

/LING Yong-chang，LIU Xiang，ZHANG Ying，etal.//Medical Innovation of China，2015，12（27）：012-015

Objective：To investigate the metabonomics features of pregnant women with cleft lip and palate fetus in order to provide diagnostic evidences for the early detection of fetus with cleft lip and palate.Method：21 pregnant women who were diagnosed with cleft lip and palate fetus through prenatal ultrasound screening in our hospital from February 2014 to April 2015 were selected as the case group，21 normal pregnant women who received the prenatal ultrasound screening in our hospital were randomly selected as the control group at the same time.The metabonomics features of the two groups were detected through metabonomics technology based on the nuclear magnetic resonance （NMR）.The metabonomics features of the two groups were compared.Result：The plasma metabolites of the two groups were significantly different.The contents of phenylalanine，valine and tyrosine in the case group were higher than those in the control group.The contents of alanine，choline and phosphorylcholine in the case group were lower than those in the control group.Conclusion：NMR-based metabonomics can well reflect the metabolic changes in pregnant women with cleft lip and palate fetus.It can obtain corresponding metabolites features and has important clinical application prospect.

Cleft lip and palate； Pregnant women； Plasma； Metabonomics

江西省衛生廳科技計劃（20141116）

①贛南醫學院第一附屬醫院 江西 贛州 341000

凌永昌

（2015-06-11） （本文編輯：王利）