FK1706促進外周神經移植術后大鼠神經軸突再生的研究*

肖毓華　徐　杰

FK1706促進外周神經移植術后大鼠神經軸突再生的研究*

肖毓華①徐杰①

目的：探討FK1706是否能夠促進外周神經移植術后大鼠神經軸突再生。方法：20只雄性SD大鼠，行左側坐骨神經離斷、自體橈神經移植術。術后隨機分為兩組，A組術后當天開始患肢局部肌肉注射FK1706（0.32 mg/kg），持續8周。B組作為對照組不施加干預，僅常規喂養。術后8周，行大鼠左坐骨神經再生有髓神經纖維數及截面積測定、神經電生理檢測、左腓腸肌肌濕重測定。結果：A組近端有髓神經纖維數與B組比較差異無統計學意義（P＞0.05），但遠端有髓神經纖維數、遠端纖維截面積明顯優于B組，差異有統計學意義（P＜0.01）。A組再生有髓神經纖維的髓鞘厚度（mt）及直徑比（d/D）明顯優于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）。A組復合運動動作電位（CMAP）、運動神經傳導速度（MNCV）及腓腸肌肌濕重明顯優于B組，差異有統計學意義（P＜0.01）。結論：大鼠坐骨神經移植術后應用FK1706具有神經營養作用，可加快神經功能的恢復。

FK1706； 營養神經； 自體神經移植； 神經再生

First-author's address：Fujian Provincial Hospital，Fuzhou 350001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.27.005

用移植神經的方法橋接缺損治療周圍神經完全損傷，臨床上稱神經移植術。人類周圍神經的再生速度慢，神經修復效果欠佳，臨床上希望找到一種能夠顯著促進神經再生的藥物。

1998年國外首例異體手移植成功［1］，發現用于抗異體免疫排斥的藥物FK506對神經的再生有明顯的促進作用，異體手移植的神經功能恢復顯著優于自體斷手再植［2］。基礎研究證實免疫抑制劑FK506對神經有再生及保護作用［3］，但其具有的免疫抑制的毒副作用限制了其在臨床神經修復中的應用。FK1706為FK506衍生物，是一種非免疫抑制劑。有國外研究顯示，FK1706有可能促進促使軸突生長的基因表達［4］。本實驗通過建立大鼠坐骨神經損傷神經移植模型，術后應用FK1706，探討其對神經再生的促進作用。

1　材料與方法

1.1試劑 二甲基亞砜：日本sigma-D2650；FK1706：南京大學醫藥生物技術實驗室合成；藥液配置：用電子分析天平稱取FK1706粉末0.0560 g，盛于干凈燒杯中，用移液管吸取56 mL二甲基亞砜溶液放入燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，然后將溶液移入試劑瓶中，標記為FK1706溶液，4 ℃冰箱保存備用。

1.2神經移植模型制備 以質量濃度為2.5%的苯巴比妥鈉（40 mg/kg）行腹腔麻醉后，術區常規備皮消毒，將大鼠仰臥位固定，取左側橈神經10 mm備用。改俯臥位固定，取左側臀部斜形切口長約2 cm，鈍性分離肌肉，于梨狀肌下顯露坐骨神經主干，用玻璃分針小心將周圍組織與坐骨神經主干進行鈍性分離。于梨狀肌下0.5 cm處，用刀片整齊切除8 mm長的坐骨神經。在放大10倍的手術顯微鏡下，用11-0無損傷縫合線將橈神經與坐骨神經兩斷端分別行端端吻合，兩個吻合處均縫4～6針，徹底止血后關閉切口。建立自體神經移植模型，見圖1。

圖1　神經移植模型示意圖

1.3實驗動物與分組 成年雄性健康SD大鼠20只，體重250～300 g［由福建醫科大學實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK（閩）2012-0001］，隨機分成實驗組（FK1706組）和對照組，每組10只，并用苦味酸進行標記。所有大鼠均采用專門鼠籠分籠管理，全價營養顆粒飼料喂養，由專人統一飼養，隔日更換墊料，水和食物無限制供給，飼養環境維持室溫20 ℃。實驗過程中對動物的處置符合科學技術部2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見的要求》［5］。術后大鼠分籠，在相同條件下飼養，自然蘇醒，并于術后當天開始，實驗組大鼠每日1次，于左大腿外側肌肉注射FK1706溶液0.32 mg/kg，連續給藥直至術后8周。對照組神經移植術后不做干預，常規喂養。

1.4觀察指標與方法 神經電生理測定：術后8周應用Medtronic Keypoint肌電/誘發電位儀對實驗動物進行坐骨神經電生理檢測。以質量濃度為2.5%的苯巴比妥鈉（40 mg/kg）對大鼠實施腹腔麻醉，取俯臥位固定，術區常規備皮消毒，顯露大鼠左側坐骨神經，并解剖出腓腸肌，將針形記錄電極插入腓腸肌肌腹，接地電極置于大鼠尾部。以平行刺激電極（兩極間距固定為2 mm）分別置于坐骨神經吻合口近端坐骨結節水平（P點）和遠端坐骨神經分支處（D點），進行超強刺激（電流10 mA），重復刺激數次，待示波器屏幕顯示的誘發電位圖形穩定、起點清楚后凍結圖形，記錄復合運動動作電位（Compound Motor Action Potential，CMAP），并測定其波幅，用游標卡尺測量并輸入刺激電極間距離，計算出運動神經傳導速度（Motor Nerve Conduction Velocity， MNCV）。MNCV=兩次刺激電極間距離/動作電位潛伏期差值。整個電生理檢測過程均在28 ℃室溫下進行，并經常用生理鹽水保持受檢肌肉處于濕潤狀態。

有髓神經纖維數與截面積：肌電圖檢查完畢后，于坐骨神經近近端吻合口3 mm、遠遠端吻合口3 mm處取材（大小約2～3 mm）。以質量分數為10%的福爾馬林固定，切片厚0.5 μm，HE染色。用Olympus光學顯微鏡，在放大400倍的視野下，計算有髓神經纖維總數。用TJTY-300圖像分析儀，在目鏡放大40倍、定標值為0.38 μm/象數的條件下測定有髓神經纖維截面積。規定1條過中心的直線，測定此直線上有髓神經纖維的截面積。

再生有髓神經纖維的髓鞘厚度（mt）及直徑比（d/D）：于坐骨神經近近端吻合口3 mm、遠遠端吻合口3 mm處及移植神經的中點處取材（大小約2～3 mm）。取材后，于4 ℃環境下，先經3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定24 h，再用1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定1.5 h，PBS漂洗；70%酒精飽和醋酸鈾染液塊染，酒精-丙酮梯度脫水，環氧樹脂618包埋劑包埋。超薄切片80 nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛各染色5 min；在飛利浦EM 208型透射電鏡下觀察、攝影。每個標本在放大1000倍的條件下，隨機選取3個視野拍攝照片。用TJTY-300圖像分析儀，在目鏡放大40倍、定標值為0.38 μm/象數的條件下測定橢圓髓鞘的內徑（ai、bi）、外徑（ao、bo），內周長（Pi）、外周長（Po），內面積（Ai）、外面積（Ao）。根據下列公式（圖2）計算有髓神經纖維的髓鞘厚度（mt）和軸突纖維的直徑比（d/D）［8］。

圖2　mt和d/D的計算公式

肌濕重：鈍性分離肌肉，完整取下大鼠左側的腓腸肌，剔除表面結締組織，即刻置于Sartorius-BS224S電子分析天平上稱重，測定肌肉濕重。

1.5統計學處理 采用計算機軟件SPSS 17.0對數據進行統計分析，計量資料以（x-±s）表示，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1一般情況 由于麻醉意外死亡2只，及時補齊總數。建立模型動物均于術后2 h內完全蘇醒，圍手術期存活率100%，實驗大鼠切口愈合良好，無切口感染情況發生。實驗觀察期間各組大鼠進食及健康狀況良好。

2.2兩組神經電生理測定結果比較 術后8周，與對照組相比，FK1706組CMAP的波幅明顯較高，運動神經傳導速度更快，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　兩組神經電生理結果比較（±s）

表1　兩組神經電生理結果比較（±s）

組別CMAP波幅（mV）MNCV（m/s）實驗組（n=10）7.34±1.226.07±0.95對照組（n=10）6.07±1.183.78±0.46 t值2.3576.808 P值0.030＜0.001

2.3兩組有髓神經纖維數與截面積比較 坐骨神經遠端吻合口處，實驗組再生有髓神經纖維數及截面積情況明顯優于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2　兩組有髓神經纖維數及橫截面積比較（±s）

表2　兩組有髓神經纖維數及橫截面積比較（±s）

組別 有髓神經纖維數 根遠端纖維截面積（μm2）近端 遠端實驗組（n=10）1199.53±113.73 701.17± 78.4022.53±6.52對照組（n=10）1164.73±71.39532.78±100.6814.39±3.13 t值0.8194.1733.561 P值0.4230.0010.004

2.4兩組電鏡觀察結果比較 在透視電鏡下，觀察到坐骨神經近近端吻合口、遠遠端吻合口處以及移植神經中點處實驗組的再生有髓纖維數量較多而粗大，排列較整齊有序，結構清晰，結締組織含量少，對照組再生有髓纖維數量較少而纖細，排列較稀疏，結締組織增生。兩組間再生有髓神經纖維的髓鞘厚度與d/D比值差異具有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3　兩組電鏡觀察結果比較（±s）

表3　兩組電鏡觀察結果比較（±s）

組別再生纖維髓鞘厚度（μm）再生纖維d/D比值實驗組（n=10）0.1523±0.05200.6364±0.1199對照組（n=10）0.1017±0.07730.4969±0.1396 t值2.2302.397 P值0.0390.028

2.5兩組肌濕重比較 術后8周，實驗組腓腸肌肌濕重為（805.91±98.82）mg，重于對照組的（702.26±78.46）mg，組間比較差異具有統計學意義（t=2.598，P＜0.05）。

3　討論

周圍神經損傷后的功能恢復受到年齡、神經損傷平面、損傷神經及其類型、神經損傷機制與程度、神經修復時機、神經修復技術、合并損傷、術后處理及康復訓練等一系列因素的影響［6］。譬如，從損傷到對去神經肌肉實現神經重建之間耽誤的時間，對于功能恢復具有重要的影響［7］。許多因素決定了延誤時間的長短，包括損傷后開始接受治療干預的時間、損傷部位到去神經肌肉之間的距離和神經軸突的再生速度。軸突的再生速度大約是每日1～3 mm［8-9］。以臨床為例，上肢神經損傷后需要再生距離通常是10～70 cm，以軸突延長的速度來計算，神經再生所需的時間高達24個月。而Mackinnon等［10］在臨床工作中發現，遠端肌肉所能承受最長的去神經時限僅是12個月。而恢復時間延長又可降低恢復的質量，因而外周神經損傷后修復一直是外科棘手的難題。

迄今為止，FK506是唯一表現出持續的加速神經再生作用的治療手段［11］。其已被證實在一系列中樞神經和周圍神經損傷模型中發揮加速神經再生和功能恢復的療效［12-20］。但由于其免疫抑制功效，限制了其臨床長期應用。合成的FK1706在保留了FK506的促進神經修復再生特性的同時，去除了免疫抑制的副作用，使其具有廣闊的臨床前景。

非免疫抑制的免疫親和素FK1706具有神經生長和神經保護功能的化合物，其合成的前身是免疫抑制劑FK506，目前針對其主要作用的兩種免疫親和配體FKBP-12和FKBP-52的研究眾多。周圍神經損傷后，神經生長相關蛋白-43（GAP-43）含量可增加20～100倍［21］。神經生長相關蛋白-43（GAP-43）的活性增加，可促使神經再生。既往研究發現，FK506進入細胞內，與胞漿中的FKBP-12相結合，形成FK506-FKBP12復合物，該復合物可通過抑制對神經生長相關蛋白-43（GAP-43）具有抑制作用的神經鈣蛋白（CaN）［22］，進而發揮促進神經生長的功效。也有觀點認為，抑制神經鈣蛋白（CaN）活性，也是發揮其免疫抑制功效的開始，這一說法尚未得到證實，但是抑制神經鈣蛋白（CaN）活性，確實具有促進神經生長的作用。目前研究認為，FKBP-12存在兩種結合配體，分別具有和不具有抑制神經鈣蛋白（CaN）活性的作用，而限制神經鈣蛋白（CaN）的磷脂酶活性，可能對FK506發揮神經保護作用影響重大。Udina等［23］通過脛神經擠壓和橫斷模型，認為無CaN抑制活性的非免疫抑制免疫親和素V-10367并不具備促進損傷后脛神經再生修復功能，Udina等［24］在對另一種無CaN抑制活性的非免疫抑制免疫親和素GPI-1046的研究中，也得出了相同的結果，并認為其不具備神經保護作用。

FK1706對于FKBP-12和FKBP-52兩種FKBP亞型具有基本相似的高親和力，其與FKBP-12結合形成的復合物是否具有抑制CaN的活性，尚無研究證據支持。但在抑制T細胞增殖和白介素-2合成方面，與FK506相比，卻僅有相當微弱的功效，或者說至少在促進神經軸突生長的劑量范圍內，并沒有出現免疫抑制的情況。FK1706是否具有抑制CaN的活性尚不明確，而FK1706的促進神經生長的功效又有廣大實驗研究證據支持，因此筆者推斷，如果FK1706具有抑制CaN的活性，則抑制CaN的活性與發揮免疫抑制功效無必然關聯，如果FK1706不具有抑制CaN的活性，則其所具備的促進神經生長作用可能通過其他機制實現。

目前研究發現，FK1706的神經生長作用可能是通過與FKBP-52結合并活化下游Ras/Raf/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路，引起神經生長因子（NGF）介導的神經軸突生長來實現的［25］，但FKBP-52和神經生長因子（NGF）信號轉導通路之間的銜接點尚未明確。FK1706的促進神經損傷修復再生的功效不僅呈現劑量依賴性，并且有良好的治療時間窗。

在劑量與給藥途徑的選擇上，Yamaji等［25］曾就長期應用FK1706對大鼠脊髓挫傷后運動功能恢復的治療效果進行研究，通過每日單次肌肉注射FK1706，連續給予29 d，通過傾斜平板試驗評價其對運動功能障礙的改善情況。該研究不僅發現，FK1706能顯著提高脊髓挫傷后大鼠在傾斜平板試驗中的得分，還通過分組給予不同治療劑量FK1706，觀察FK1706對脊髓挫傷后大鼠運動功能恢復的量效關系。

本實驗研究對坐骨神經損傷大鼠進行橈神經移植，術后給予FK1706局部肌肉注射，連續治療8周。在術后8周時，FK1706組坐骨神經電生理功能檢測結果明顯優于對照組，并且在神經肌肉結構方面也有顯著改善，主要表現在腓腸肌肌濕重、遠端有髓神經纖維數目等方面均有所增加。因此，FK1706不僅有利于能顯著改善神經移植動物術后神經電生理功能，在對于相關神經結構損傷修復，如增加有髓神經纖維數目和橫截面積以及腓腸肌肌濕重等，也同樣有效。

然而筆者也觀察到，遠端神經軸突的再生情況仍有些不滿意，原因可能有：（1）給藥劑量；（2）給藥方式與時間；（3）觀察的時間點。今后研究中將更加關注藥物濃度對效果的影響，以及選擇合適的給藥方式與觀察的時間點。

本實驗研究證實了，FK1706能顯著促進神經移植動物術后神經再生，為FK1706可能作為一種潛在的顯著促神經再生作用藥物用于周圍神經損傷提供了實驗依據。

［1］ Dubermard J M，Owen E，Herzberg G，etal. Human hand allograft：Report on first 6 months［J］.Lancet，1999，353 （9161）：1315-1320.

［2］裴國獻，顧立強.異體手移植兩例報告［J］.中華醫學雜志，2000，80（6）：417-421.

［3］ Minematsu T，Lee J，Zha J，etal.Time-dependent inhibitory effects of （1R，9S，12S，13R，14S，17R，18E，21S，23S，24R，25S，27R）-1，14-dihydroxy-12-（E）-2-［（1R，3R，4 ）-4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl］-1-methylvinyl-23，25-dimethoxy-13，19，21，27-tetramethyl-17-（2-oxopropyl）-11，28-dioxa-4-azatricyclo［22.3.1.0（4.9）］octacos-18-ene-2， 3，10，16-tetrone （FK1706）， a novel nonimmunosuppressive immunophilin ligand， on CYP3A4/5 activity in humans in vivo and in vitro［J］. Drug Metab Dispos， 2010，38（2）：249-259.

［4］ Yamazaki S，Yamaji T，Murai N，etal.FK1706，a novel nonimmunosuppressive immunophilin ligand， modifies the course of painful diabetic neuropathy［J］.Neuropharmacology，2008，55（7）：1226-1230.

［5］科技部.關于善待實驗動物的指導性意見［J］.［2011-07-09］. http：// wenku.baidu.com/view/c4042a8a84868762caaed585.html， 2006.

［6］ Goto T，Kino T，Hatanaka H，etal.Discovery of FK-506，a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces tsukubaensis［C］. Transplantation Proceedings，1987，19（5 Suppl 6）：4.

［7］ Kobayashi J，Mackinnon S E，Watanabe O，etal.The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the ratmodel［J］.Muscle & Nerve，1997，20（7）：858-866.

［8］ Gutmann E，Guttmann L，Medawar P B，etal.The rate of regeneration of nerve［J］.Journal of Experimental Biology， 1942，19 （1）：14-44.

［9］ Pan Y A，Misgeld T，Lichtman J W，etal. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo［J］.The Journal of Neuroscience，2003，23 （36）：11 479-11 488.

［10］ Mackinnon S E，Dellon A L.Surgery of the peripheral nerve［M］.New York： Thieme Medical Publishers， 1988.

［11］ Yan Y， Sun H H， Hunter D A， etal. Efficacy of short-term FK506 administration on accelerating nerve regeneration［J］. Neurorehabilitation and Neural Repair， 2012， 26（6）： 570-580.

［12］ Chabas J F， Alluin O， Rao G， etal. FK506 induces changes in muscle properties and promotes metabosensitive nerve fiber regeneration［J］. Journal of Neurotrauma， 2009， 26（1）： 97-108.

［13］ Gold B G，Katoh K，Storm-Dickerson T.The immunosuppressant FK506 increases the rate of axonal regeneration in rat sciatic nerve［J］. The Journal of Neuroscience，1995，15（11）： 7509-7516.

［14］ Jensen J N， Brenner M J， Tung T H， etal. Effect of FK506 on peripheral nerve regeneration through long grafts in inbred swine［J］. Annals of Plastic Surgery， 2005， 54（4）： 420-427.

［15］ Jost S C， Doolabh V B， Mackinnon S E， etal. Acceleration of peripheral nerve regeneration following FK506 administration［J］. Restorative Neurology and Neuroscience， 2000，17（1）：39-44.

［16］ Lee M， Doolabh V B， Mackinnon S E， etal.FK506 promotes functional recovery in crushed rat sciatic nerve［J］.Muscle & Nerve，2000， 23（4）： 633-640.

［17］ Sobol J B， Lowe Iii J B， Yang R K， etal. Effects of delaying FK506 administration on neuroregeneration in a rodent model［J］. Journal of Reconstructive Microsurgery， 2003， 19（02）： 113-118.

［18］ Sulaiman O A R， Voda J， Gold B G， etal. FK506 increases peripheral nerve regeneration after chronic axotomy but not after chronic Schwann cell denervation［J］.Experimental Neurology，2002，175（1）：127-137.

［19］ Udina E， Ceballos D， Gold B G， etal. FK506 enhances reinnervation by regeneration and by collateral sprouting of peripheral nerve fibers［J］. Experimental Neurology， 2003， 183（1）： 220-231.

［20］ Yang R K， Lowe Ⅲ J B， Sobol J B， etal. Dose-dependent effects of FK506 on neuroregeneration in a rat model［J］. Plastic and Reconstructive Surgery， 2003， 112（7）： 1832-1840.

［21］ 許建中， 李起鴻. 生長相關蛋白-43 與周圍神經損傷及再生［J］.中華創傷雜志， 1999， 15（5）：391-392.

［22］ Dawson T M，Steiner J P，Lyons W E，etal.The immunophilins，FK506 binding protein and cyclophilin， are discretely localized in the brain： relationship to calcineurin［J］. Neuroscience， 1994， 62（2）：569-580.

［23］ Udina E， Rodr í guez F J， Verdú E， etal.FK506 enhances regeneration of axons across long peripheral nerve gaps repaired with collagen guides seeded with allogeneic Schwann cells［J］.Glia，2004，47（2）：120-129.

［24］ Udina E， Verdú E， Navarro X. Effects of the immunophilin ligand FK506 on nerve regeneration in collagen guides seeded with Schwann cells in rats［J］. Neuroscience Letters， 2004， 357（2）： 99-102.

［25］ Yamaji T， Yamazaki S， Li J， etal. FK1706，a novel nonimmunosuppressant neurophilin ligand， ameliorates motor dysfunction following spinal cord injury through its neuroregenerative action［J］.European Journal of Pharmacology， 2008， 591（1）： 147-152.

The Study of FK 1706 on Promoting the Axon Regeneration of Peripheral Nerves for Rats after Neural Transplantation

/XIAO Yu-hua，XU J ie.//Medical Innovation of China，2015，12（27）：016-020

Objective：To investigate whether FK1706 can promote the axon regeneration of peripheral nerve for rats after neural transplantation.Method：20 male SD rats were randomly assigned into two groups after they were performed with left sciatic nerve transection and autologous radial nerve grafting.Group A received FK1706 （0.32 mg/kg） local intramuscular injected once a day on left lower limb for 8 weeks， while Group B as control were routinely fed without special intervention. Electrophysiological studies of left sciatic nerve were performed.The number and area of the regenerated myelinated nerve fiber in cross section pane， and wet muscle weight of the left gastrocnemius muscle were measured，respectively，at 8 weeks after operation.Result：The number of myelinated nerve fiber in proximal end， two groups has no significant difference in statistic （P＞0.05）， however， in distal end，number of myelinated nerve fiber in Group A was significantly higher than in Group B（P＜0.01）. The thickness of myelin sheath （mt） of the myelinated nerve fiber， and the ratio that bare axon diameter divided by the total fiber diameter （d/D） were more favorable in Group A than the other， which difference has statistical significance（P＜0.05）.The wet muscle weight of left gastrocnemius muscle， as well as the compound motor action potential （CMAP） amplitude and motor nerve conduction velocity （MNCV） in Group A，were much better than in Group B，with significant differences （P＜0.01）.Conclusion：FK1706 has neurotrophy effect that，significantly promote neuroregeneration in rats after autologous nerve transplantation repairing surgery.

FK1706； Neurotrophy； Nerve autograft； Neuroregeneration

福建省衛生廳中青年骨干人才項目（2013-ZQNZD-1）

①福建省立醫院 福建 福州 350001

徐杰

（2015-07-03） （本文編輯：陳丹云）