siRNA干擾SIAH對細胞活性和α-synuclein泛素化降解通路的影響*

徐　晶　張馨芝　張永進　李秀明　王　敏　蔡增林　李小民

siRNA干擾SIAH對細胞活性和α-synuclein泛素化降解通路的影響*

徐晶①張馨芝①張永進①李秀明①王敏①蔡增林①李小民①

目的：研究siRNA干擾SIAH基因對神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y細胞α-synuclein泛素化、降解通路的影響。方法：用熒光標記的siRNA-FAM轉染SH-SY5Y細胞后，專業設計合成3條針對SIAH的siRNA，Western Blot檢測蛋白水平SIAH表達的變化，篩選出其中最高效的1條siRNA，用CCK-8法檢測該siRNASIAH干擾SH-SY5Y細胞活性；流式細胞技術檢測該siRNA-SIAH干擾SH-SY5Y細胞凋亡的影響；Western Blot檢測α-synuclein、LC3、E1、P53蛋白水平表達的變化；qRT-PCR檢測SIAH、α-synuclein、LC3、E1 mRNA水平表達的變化；免疫共聚焦分別檢測SIAH、α-synuclein、LC3共定位情況。結果：3條siRNA均成功轉染SH-SY5Y細胞，流式細胞術檢測siRNA轉染SH-SY5Y細胞轉染率89%，Western結果顯示其中siRNA-2#使細胞中SIAH蛋白表達明顯降低，選取該序列進行研究。CCK-8法結果顯示該siRNA干擾SIAH后對SH-SY5Y細胞活增高，流式細胞技術檢測結果顯示該siRNA干擾SIAH可抑制SH-SY5Y細胞的凋亡，與空白對照組、陰性對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。通過Western Blot檢測siRNA-2#組的α-synuclein、LC3、P53蛋白水平，與空白對照組、陰性對照組比較均明顯降低，E1蛋白水平增高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。通過qRT-PCR檢測siRNA-2#組的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ mRNA水平與空白對照組、陰性對照組比較均明顯降低，而E1的mRNA水平明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：應用siRNA干擾SIAH基因，通過促進泛素-蛋白酶體系統作用減少SH-SY5Y中α-synuclein聚集，SIAH基因有可能成為帕金森病治療中的一個新靶點。

帕金森病； E3泛素連接酶； α-synuclein； 泛素化蛋白酶體

First-author's address：Affiliated L ianyungang Hospital of X uzhou Medical College，L ianyungang 222002，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.27.001

帕金森病（Parkinson's Dieaese，PD）是阿爾茨海默病后的第二大最常見的神經系統變性疾病，65歲以上的發病率約1%［1］。它的特點是黑質致密部及其他腦干區域多巴胺能神經元變性和丟失，其主要臨床表現為靜止性震顫，運動徐緩、強直、姿勢不穩定以及其他各種運動和非運動功能［2-3］。不管家族性或散發的帕金森病，其主要病理學標志是以胞質內α-synuclei聚集物為主的路易小體形成［4］。E3泛素連接酶—SIAH （seven in absentia homolog）能夠使α-synuclein中的賴氨酸單泛素化，并能夠促進其聚集而發揮對細胞的毒性作用［5］。本研究采用siRNA技術干擾SH-SY5Y細胞的SIAH活性，從而抑制α-synuclein的單泛素化，阻止細胞的死亡，為PD的靶向治療尋找有效的調控靶位，提供新的治療方法。

1　材料與方法

1.1材料 SH-SY5Y細胞為蘇州大學神經科學研究所惠贈，胎牛血清購自Hyclone有限公司，DMEM/ F12購自Gibco公司、LipofectamineTM2000購自上海Invitrogen公司，CellCountingKit-8（CCK-8）購自Dojindo公司，TRNzol試劑、逆轉錄試劑盒購自Takala公司，引物由英俊科技有限公司設計合成，蛋白上樣緩沖液（5X）購自碧云天生物技術研究所，BCA蛋白定量試劑盒購自美國Bioworde公司，Marker購自Thermo公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 含血清濃度10%的DMEM/F12培養基培養SH-SY5Y細胞，細胞培養于6 cm細胞培養皿中。每2～3天用0.1%的胰酶消化將細胞傳代，細胞換液時加入培養液3 mL/次，培養皿放置于溫度37 ℃、二氧化碳（CO2）濃度為5%的孵箱中培養。

1.2.2SIAHsiRNA的設計合成 由蘇州吉凱公司設計合成SIAH基因的3條siRNA，siRNA1、siRNA2和siRNA3。序列分別為siRNA1序列：5'-GCUCACAUGUUGUCCAACUTT-3'，其Anti-sense 為5'-AGUUGGACAACAUGUGAGCTT-3'；siRNA2序列：5'-CCUGGUGCUUCCUGUAAAUTT-3'，Antisense 為5'-AUUUACAGGAAGCACCAGGTT-3'；siRNA3序列為5'-GCGACUGUCUAGUCUUUGATT-3'，其Antisense為5'-UCAAAGACUAGACAGUCGCTT-3'。

1.2.3實驗分組與細胞轉染處理 實驗分空白對照組（即未處理細胞組）、siRNA干擾組（siRNA-1#組、siRNA-2#組和siRNA-3#組）和陰性對照組，轉染操作按照Invitrogen公司LipofectamineTM2000說明書進行。

1.2.4CCK-8法測SH-SY5Y細胞轉染SIAH-siRNA后細胞活性 將細胞鋪板96孔板，按照上述步驟進行轉染，置于37 ℃、飽和濕度、5%的CO2條件下常規培養48 h后，內加入10 μL的CCK8/孔，再置于37 ℃孵育2 h。然后直接在酶聯檢測儀上450 nm波長處測A450值，以A450間接反映細胞存活數量。實驗重復三次，據公式細胞存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%計算存活率，可推算SIAH-siRNA轉染后48 h細胞的存活率。

1.2.5流式法測SH-SY5Y細胞轉染SIAH-siRNA后細胞凋亡 采用Annexin-V雙染色檢測早期凋亡細胞。用12孔板處理細胞，每孔接種細胞1.8×105個，各組設計復孔3個。轉染同前，siRNA用量為2.5 pmoL/孔，脂質體為2.5 μL/孔。轉染48 h后終止孵育，經消化處理收獲各組細胞，細胞在預冷的PBS中清洗2次，重新離心，去除上清液，再用1×Annexin結合緩沖液混懸細胞，測定細胞密度，稀釋至1×106個/mL。取100 μL，加入5 μL Annexin-V和1 μL的100 μg/mL操作液。室溫孵育15 min，加入400 μL的1×Annexin結合緩沖液，輕輕混合，上機檢測。

1.2.6Western Blot法測SH-SY5Y細胞轉染SIAH-siRNA后蛋白表達水平 將SH-SY5Y細胞以1×105/mL種于6孔培養板中，每孔OPI-MEM培養基2 mL，按Lipofectamine2000說明書的條件轉染，分3個組：實驗分空白對照組（即未處理細胞組）、siRNA干擾組（siRNA-1#組、siRNA-2#組和siRNA-3#組）和陰性對照組，轉染后6 h，換含10%血清的DMEM/F12新鮮培養液。轉染72 h后，獲取細胞，提取蛋白，蛋白定量，Western blot進行蛋白電泳，PVDF膜轉膜1.5 h，脫脂牛奶封閉1 h，一抗4度孵育過夜SIAH （1∶100 SantaCruz America）、α-synuclein（1∶1000 Abcam USA）、LC3（1∶2000 Abcam USA）、E1 （1∶1000，Cell Signaling， USA）、P531∶1000 Abcam USA），用相應的HRP標記的二抗孵育室溫2 h，ECL反應、壓片、顯影、定影，用ImageJ軟件分析系統處理結果。

1.2.7qRT-PCR法測SH-SY5Y細胞轉染SIAH-siRNA后mRNA表達水平 將SH-SY5Y細胞以5×104/mL種細胞于12孔培養板中，每孔OPIMEM培養基1 mL，按照Lipofectamine2000說明書的條件轉染細胞，分3個組：實驗分空白對照組（即未處理細胞組）、siRNA干擾組（siRNA-1#組、siRNA-2#組和siRNA-3#組）和陰性對照組，轉染后6 h，換含10%血清的DMEM/F12新鮮培養液。轉染后48 h，提RNA，反轉錄備cDNA，定量PCR儀上應用檢測SIAH的表達。SIAH基因cDNA上游引物5'CTGTCGCCCCAAACTTACAT-3'，下游引物5'-CAAGGAGCCTTGCCACTTAC-3'，α-synuclein基因cDNA上游引物5'-CCTCAGCCCAGAGCCTTTC-3'，下游引物5'-CCTCTGCCACACCCTGCTT-3'；LC3基因cDNA上游引物5'-GAGTGGAAGATGTCCGGCTC-3'，下游引物5'-CCAGGAGGAAGAAGGCTTGG-3'；E1基因cDNA上游引物5'-CCCTACATGACCAAGGCACT-3'，下游引物5'-CCAGGAGGAAGAAGGCTTGG-3'；建立Q-PCR反應體系，每個樣品擴目的基因和內參各3個重復。

1.2.8免疫共聚焦法觀察SH-SY5Y細胞轉染SIAH-siRNA后SIAH、LC3、α-synuclein的共定位 將SHSY5Y細胞以1×105/mL種于共聚焦培養皿中，轉染方法同前，轉染24 h后PBS沖洗干凈，用4%多聚甲醛固定15 min，棄之，用pbs沖洗10 min×3遍。Trion-X-100打孔20 min，PBS沖洗10 min×3遍。5% 的BSA封閉1 h（37 ℃培箱，BSA用PBS配制），PBS 洗10 min×3遍。一抗孵育4度過夜SIAH（1∶100 SantaCruz America）、α-synuclein（1∶100 Abcam USA）、LC3（1∶200 Abcam USA），回收一抗，PBS洗10 min ×3遍，二抗孵育37℃ 2 h，PBS洗10 min×3遍，DAPI染10 min，PBS10 min×3遍，用蔡司共聚焦顯微鏡觀察其定位情況。

1.3統計學處理 使用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計量資料采用（x-±s）表示，多組間比較使用單向方差分析（ANOVA，LSD），以P＜0.05為差異有統計學意義，PCR結果利用2-ΔΔCt法統計數據。

2　結果

2.1流式測轉染率用FAM轉染SH-SY5Y細胞6h后，用流式測轉染率，其轉染率可達89%。

2.2siRNA干擾SIAH對SH-SY5Y細胞SIAH蛋白表達的抑制 轉染不同siRNA序列對SIAH蛋白表達的影響轉染72 h后SIAH蛋白western blot電泳圖，用Image J分析條帶灰度值，并用β-actin做標準化，轉染siRNA-1#組、siRNA-2#組、siRNA-3#序列后，轉染siRNA-2#組后SIAH蛋白表達低于陰性對照組和空白對照組，即篩選siRNA-2#組進行如下研究。

2.3CCK-8法測SH-SY5Y細胞轉染SIAH-siRNA后細胞活性 CCK-8法檢測轉染siRNA-2#序列后與空白對照組和陰性對照組細胞活性相比，轉染SIAH-siRNA 48 h后SH-SY5Y細胞活性比空白對照組、陰性對照組均有顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），而空白對照組與陰性對照組之間變化不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1　SIAH-siRNA對SH-SY5Y細胞活力改變

2.4流式法測SH-SY5Y細胞轉染SIAH-siRNA后細胞凋亡 流式法檢測轉染siRNA-2#序列后與正常細胞組和陰性對照組細胞凋亡率相比，轉染SIAH-siRNA 24 h后SH-SY5Y細胞凋亡率比空白對照組、陰性對照組均有顯著減少，差異均有統計學意義（P＜0.05），而空白對照組與陰性對照組之間變化不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2　SIAH-siRNA對SH-SY5Y細胞凋亡改變

2.5Western Blot法測SH-SY5Y細胞轉染SIAH-siRNA后蛋白表達水平 與空白對照組相比，siRNA-2#組的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ、P53蛋白水平均下降（t=2.931、3.307、5.506、3.326，P=0.0408、0.0297、0.0053、0.0292，），E1表達升高（t=3.480，P=0.0254）；與陰性對照組相比較，siRNA-SIAH組的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ、P53蛋白水平均下降（t=5.178、4.851、5.941、4.400，P=0.0066、0.0083、0.0040、0.0117），E1表達升高（t=3.765，P=0.0197），見圖3～7。

圖3　SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細胞后SIAH改變

圖4　SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細胞后LC3-Ⅱ改變

圖5　SIAH1-siRNA 干擾SH-SY5Y細胞后α-synuclein改變

圖6　SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細胞后P53改變

圖7　SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細胞后E1改變

2.6qRT-PCR法測SH-SY5Y細胞轉染SIAH-siRNA 后mRNA表達水平 siRNA-SIAH組與空白對照組相比，SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ的mRNA水平均下降（t=11.04、16.70、12.98，P＜0.05），E1表達升高（t=8.739，P=0.0128）；與陰性對照組相比較，siRNASIAH組的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱ的mRNA水平均下降（t=6.066、16.58、4.043，P=0.0009、0.0036、0.0040），E1表達升高（t=9.170，P=0.0117），見圖8。

圖8　SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細胞后mRNA水平改變

2.7免疫共聚焦法觀察SH-SY5Y細胞轉染SIAH-siRNA 后SIAH、LC3、α-synuclein的共定位 將SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細胞后，SIAH與α-synuclein的信號強度減弱，且SIAH與α-synuclein失去共定位，表明干擾SIAH基因能使α-synuclein聚集減少；將SIAH-siRNA干擾SH-SY5Y細胞后，LC3-Ⅱ與α-synuclein的信號強度減弱，表明干擾SIAH基因，導致自噬溶酶體成熟障礙。

3　討論

帕金森病的主要病理學標志為黑質致密部神經體內Lewy小體，異常的α-synuclein聚集是Lewy小體的重要組分，因此α-synuclein聚集是帕金森發生、發展的一個中心環節［6］。α-synuclein有不規則聚集體、可溶性寡聚體或者類似小纖維三種主要存在形式，而這三個種類都有潛在的神經毒性，多數資料認為可溶性寡聚體表現出更大的細胞毒性而導致神經元喪失［7］。在正常神經元內，α-synuclein的生成與降解之間保持著動態平衡［8］。泛素-蛋白酶體系統（Ubiquitin-proteasome system，UPS）和自噬-溶酶體途徑（Autophagy-lysosome pathway，ALP）是機體正常修復或者清除異常蛋白的最主要兩種路徑。蛋白酶體是一桶狀多蛋白復合體，主要降解短壽的細胞核與細胞質蛋白，然而底物需要展開并通過蛋白酶體圓柱體狹窄的孔隙，這阻礙了低聚物和聚集蛋白的清除［9-10］。自噬是在溶酶體內清除細胞內變構和錯誤折疊的易聚集蛋白，這些蛋白多聚體對神經元有毒性并最終導致神經元的死亡，而自噬功能障礙可能是這些蛋白在受損神經元內積聚的主要原因［8］。研究表明，自噬途徑主要降解不可溶性聚集蛋白，而UPS可以降解可溶性α-synuclein［11-12］。蛋白酶體通路可以清除經多聚泛素化后的α-synuclein，體內和體外實驗研究表明，E3泛素連接酶—SIAH（Seven in absentia homolog）能夠使α-synuclein 中的賴氨酸泛素化，并能夠促進其聚集而對細胞產生毒性作用［13］。而SIAH所介導的α-synuclein單泛素化形成的聚集體只能通過自噬途徑降解，因此筆者猜測可以通過干擾SIAH功能而減少α-synuclein的聚集及Lewy的形成，為PD的治療提供新的方案。

目前筆者實驗研究結果表明：將siRNA-SIAH轉染細胞后，細胞活性增加，細胞凋亡率減少，可能是SIAH-1蛋白水平下降，P53蛋白水平受抑制，使P53誘導的細胞凋亡減少，這與文獻［14］報道結果是一致的。siRNA-SIAH轉染SH-SY5Y細胞后，SIAH的蛋白水平及mRNA水平均明顯降低，SIAH能使α-synuclein單泛素化并促進其聚集從而產生多巴胺神經元細胞毒性［5］。實驗結果表明：抑制SIAH后，蛋白水平上單泛素化α-synuclei降低，mRNA水平也證實這一點，免疫熒光共聚焦顯微鏡可明顯觀察到α-synuclei的含量減少。因此筆者認為，抑制SIAH活性，可以抑制α-synuclein單泛素化及其聚集。干擾SIAH后，自噬泡標記物LC3-Ⅱ在蛋白水平及mRNA水平上均減少，免疫熒光共聚焦顯微鏡也證實了這一點。因此，干擾SIAH活性，可能引起自噬活性減低。然而，干擾SIAH后，E1的表達在蛋白水平及mRNA水平上都增加，使UPS通路活性增加。SIAH介導的α-synuclein單泛素化的聚集及多巴胺神經元內形成聚集物［15］。所以，筆者認為，抑制SIAH的活性，能抑制α-synuclein的單泛素化及其聚集，使得單體水平增加，這些單體通過UPS通路而不是自噬通路降解。

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Effect of siRNA Interference SIAH on Cell Activity and α-synuclein Ubiquitin Degradation Pathway

/XU J ing，ZHANG Xin-zhi，ZHANG Yong-jin，etal.//Medical Innovation of China，2015，12（27）：001-005

Objective：To study the effect of siRNA-SIAH on α-synuclein autophagy and UPS degradation in SH-SY5Y.Method：After transfection of siRNA-FAM cells with fluorescent labeled SH-SY5Y， 3 siRNA were professional designed for SIAH，the protein level of SIAH expression was measured by Western Blot， one of the most efficient siRNA was selected.CCK-8 assay was used to detect the activity of siRNA-SIAH in SH-SY5Y cells. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of siRNA-SIAH in SH-SY5Y cells.Western Blot was used to detect the protein level expression ofα-synuclein，LC3，E1，and P53.qRT-PCR was used to detect the level of mRNA in SIAH，α-synuclein，LC3 and E1. Confocal microscopy was used to detect the positioning of SIAH，α-synuclein and LC3-Ⅱ.Result： 3 siRNA cells successfully transfected SH-SY5Y，the transfection efficiency was 89%. The Western results showed that the expression of SIAH was significantly decreased in siRNA-2# cells， then studied this sequence. CCK-8 assay showed that the SH-SY5Y cell activity increased after siRNA interference， and the flow cytometry results showed that siRNA could inhibit the apoptosis of SH-SY5Y cells， which was significantly different from the control group and the negative control group（P＜0.05）.With Western Blot method，the protein levels of α-synuclein， LC3 and P53 in siRNA-2# group were significantly lower and E1 was higher than that in control group and negative control group， the differences were statistically significant（P＜0.05）.With qRT-PCR method，the mRNA level of SIAH，α-synuclein and LC3-Ⅱ mRNA in siRNA-2# group were significantly lower and E1 was higher than that in control group and negative control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion： Using siRNA to interfere with SIAH gene， SIAH gene can be used as a new target in the treatment of Parkinson's disease by promoting the ubiquitin proteasome system to reduce SH-SY5Y in α-synuclein.

Parkinson's disease； Seven in absentia homolog（SIAH）； α-synuclein； Ubiquitin-proteasome system

江蘇省自然基金面上項目（BK2011402）

①徐州醫學院附屬連云港醫院 江蘇 連云港 222002

李小民

（2015-06-03） （本文編輯：周亞杰）