木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4-NaH2PO4雙水相體系中的分配行為

蔡濤，張海德，董安華，彭健，吳蕊，朱英瑞

（海南大學食品學院，海南 海口 570228）

引 言

雙水相體系（aqueous two-phase system，ATPS）是指某些親水性的高分子聚合物與聚合物或聚合物與無機鹽溶解在水中，超過一定濃度時能自然地分成互不相溶的兩相或多相的體系[1]。該體系具有操作簡單、條件溫和等特點，已廣泛應用于核酸、蛋白質和病毒等生物產品的分離純化[2-4]，是一種很有前景的新型分離技術。

離子液體，又稱室溫熔融鹽，是指在室溫或者接近室溫的情況下完全由有機陽離子和無機或有機陰離子組成的熔鹽體系[5]。離子液體具有其他常規溶劑無可比擬的優點[6-10]，如不揮發、無色、無臭、溶解能力強、蒸氣壓極低、化學穩定性好和通過正負離子可設計目標離子液體等。離子液體雙水相體系（ionic liquids aqueous two-phase system，ILATPS）通常由一種有機鹽（親水性離子液體）、一種無機鹽（如磷酸鹽、碳酸鹽、氫氧化物等）和水形成，該雙水相體系綜合了離子液體和雙水相體系的優 點[11-12]，開辟了新的萃取分離體系。但是，對于離子液體雙水相系統的形成機理和目標物質在其中的分配行為及規律缺乏理論解釋。

近年來，對離子液體雙水相體系的研究十分活躍。王偉濤等[13]用[C4mim]Cl/K2HPO4提取木瓜蛋白酶并對其做了系統優化，木瓜蛋白酶的酶活性回收率可達到91.2%，純化因子可以達到1.73。鄧凡政等[14]用[Bmim]BF4/NaH2PO4體系對牛血清蛋白 提純，結果表明萃取率可達到99%。Du 等[15]用[Bmim]Cl/K2HPO4體系對尿液中的蛋白質提純，結果表明，分配系數可達到10，富集因子為5。Ruiz-Angel 等[16]用[Bmim]Cl/K2HPO4體系對卵清蛋白提純，結果表明分配系數可高達180。王軍等[17]用[Nebm]BF4/KH2PO4體系對α-淀粉酶提純，結果表明回收率可達到98.5%。董安華等[1]用PEG-硫酸銨組成的雙水相進行了相平衡數據的關聯，并建立了木瓜蛋白酶在該體系中的分配模型，數據關聯度較高。

離子液體雙水相成相能力的大小與離子液體在水中的溶解性和無機鹽的鹽析作用有關，溶解性越差成相能力越強，鹽析作用越弱越不利于分相，研究表明 [Cnmim]BF4較[Cnmim]Cl、[Cnmim]Br 有較強的成相能力。目前關于木瓜蛋白酶離子液體雙水相萃取的研究主要集中在系統優化這一階段，液/液相平衡的測定較少，對于其分配模型的研究報道更少。本工作采用濁點法測定[Cnmim]BF4-NaH2PO4體系在298.15 K下的雙節線并進行相平衡數據的測定和關聯，研究了木瓜蛋白酶的分配系數與該體系下雙水相組成濃度的相關度，并建立了木瓜蛋白酶在該體系中的分配模型，為工業化生產提供理論指導和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

木瓜蛋白酶（BR），生工生物（上海）股份有限公司；[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4，純度高于99%，上海成捷化學有限公司；NaH2PO4（分析純）、NaOH（分析純），廣州化學試劑廠；其他都為市售分析純。

1.2 儀器與設備

TU1901 紫外可見分光光度計，北京普析通 用有限責任公司；DK-98-1 型恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；PHS-3C 型pH 計，上海雷磁儀器廠；2WAJ 型阿貝折射儀，上海光學儀器一廠；HJ-5 型多功能恒溫攪拌器，常州華奧儀器制造有限 公司。

1.3 方法

1.3.1 相圖的測定 在298.15 K 的恒溫條件下，利用濁點法測定雙節線，制作相圖。分別取質量分數為50%的[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4溶液放在50 ml 小燒杯中，逐滴向小燒杯中滴加質量分數為40%的NaH2PO4溶液，并不斷用磁力攪拌器攪拌，直至出現渾濁點，即為兩相區。通過稱量計算出離子液體溶液和鹽溶液在渾濁點時刻的質量分數。向已渾濁的溶液中逐滴滴加去離子水，直至溶液變澄清為止，即為單相區。稱量后，再次向小燒杯中滴加質量分數為40%的NaH2PO4溶液，直至出現下一個渾濁點為止。重復上述操作。

1.3.2 離子液體雙水相相平衡的測定 以相圖為指導，選取適當的點配制離子液體雙水相體系。分別稱量不同質量的離子液體溶液和NaH2PO4固體加入5.0 ml 刻度管中，加去離子水補至5.0 ml，在恒溫振蕩器中振蕩20 min，并在25℃的環境中放置3.0 h，使體系達到平衡，溶液完全分相。上、下相離子液體的質量分數可以用折射率[18]確定，NaH2PO4的質量分數可以用酸堿中和滴定法[19]確定。

離子液體質量分數wil、折射率n、NaH2PO4質量分數ws三者的關系如下

方程參數見表1。

表1 [Cnmim]BF4-NaH2PO4 雙水相方程式(1)參數Table 1 Parameters of Eq.(1) for [Cnmim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

1.3.3 離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶 以相圖為指導，選取適當的點配制雙水相體系。分別稱量不同質量的離子液體溶液和NaH2PO4固體加入5.0 ml刻度管中，木瓜蛋白酶的添加量為1.0 mg·ml-1（木瓜蛋白酶的質量/體系體積），加去離子水補至5.0 ml，體系pH 7.0，恒溫振蕩20 min，25℃的環境下靜置3.0 h，使體系分相完全。各吸取上、下相液1.0 ml，稀釋1.0×104倍，備用。轉移1.0 ml 待測液于試管中，加入5.0 ml 考馬斯亮藍染色液，充分振蕩使之混勻，以不加酶溶液做空白，在595 nm（離子液體在該波長下沒有吸收峰）下測定該液的吸光值A并計算出木瓜蛋白酶的蛋白含量[20]。通過比較實驗可知，由于木瓜蛋白酶添加量較少，對折射率影響不大，相對誤差在0.2%以內，因此利用1.3.2 的方法測定上、下相中各組分含量。

2 結果與分析

2.1 雙節線數據的關聯，制作相圖

通過Merchuk 方程對雙節線實驗數據進行關聯，制作相圖。

式中，a、b、c為方程參數。

Merchuk 方程形式簡潔，近年來主要用于離子液體-鹽和聚合物-鹽雙節線數據的關聯，效果很好。相關系數（R2）、標準偏差（sda）和方程參數見表2。三角相圖如圖1所示。

表2 298.15 K時[Cnmim]BF4-NaH2PO4體系雙節點關聯結果Table 2 Correlation results of solubility for [Cnmim]BF4-NaH2PO4 system at 298.15 K

2.2 利用Othmer-Tobias和Bancroft方程對離子液體雙水相液液平衡數據進行關聯

Othmer-Tobias 和Bancrof 經驗關聯方程[21]的表達式如下

圖1 298.15 K 溫度下[Cnmim]BF4-NaH2PO4 雙水相體系 三角相圖Fig.1 Triangular phase diagram for [Cnmim]BF4-NaH2PO4system at 298.15 K

式中，K、n、K′、n′為方程參數，見表3；代表上相離子液體質量分數；代表下相NaH2PO4質量分數；wwb代表下相水質量分數；代表上相水質量分數。

由表3可知，Othmer-Tobias 和Bancroft 方程很好地關聯了離子液體雙水相液液相平衡的數據，線性相關系數（R2）均可達到0.994 以上。作圖2、圖3。通過回歸方程已知下相各組分含量和回歸方程參數，可以得到上相各組分含量，[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4的平均相對誤差分別為-4.51×10-7%、1.01×10-6%、-2×10-6%，NaH2PO4的平均相對誤差分別為0.014%、-0.072%、0.019%。方程的擬合結果很好，見表4。

表3 [Cnmim]BF4-NaH2PO4 雙水相方程式(3)和 式(4)中的參數Table 3 Parameters of Eqs.(3) and (4) for [Cnmim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

圖2 Othmer-Tobias 方程的線性相關性Fig.2 Linear dependency of Othmer-Tobias equation

圖3 Bancroft 方程的相關性Fig.3 Linear dependency of Bancroft equation

2.3 模型

離子液體雙水相中木瓜蛋白酶分配系數K定義為雙水相體系中上相的木瓜蛋白酶蛋白濃度（Ct）與下相的木瓜蛋白酶蛋白濃度（Cb）的比值，公式如下

表4 298.15 K 時[Cnmim]BF4-NaH2PO4 雙水相液液相平衡擬合結果Table 4 Result of liquid-liquid equilibria for [Cnmim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system at 298.15 K/% (mass)

表5 分配系數與雙水相體系組分濃度的相關性Table 5 Correlation between partition coefficient and difference in concentration of aqueous two-phase system

表6 模型參數和分配系數預測值與實驗值的相對偏差Table 6 Parameters for models calculated average relative deviations between predicted and experimental partition coefficient

變量x和y之間的相關性定義為η

式中，和是變量的平均數。分配系數和參數的相關性見表5。從表5可以得到：上相離子液體濃度與lnK的相關性均高于鹽和水，接近1；下相鹽濃度與lnK具有較好的相關性。故將上相離子液體濃度和下相鹽濃度與該體系的lnK值進行關聯，得到的公式如下

式中，A、B、C為方程參數，方程與謝紅國模型[22]相似，各參數見表6。

用上述模型擬合了木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4- NaH2PO4體系中的蛋白濃度分配系數和各組分的濃度。由表6可知相對偏差均小于5%，本工作模型與謝紅國模型相比相對偏差較小。圖4～圖6關聯了木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4-NaH2PO4體系中的蛋白濃度分配系數和各組分濃度，結果令人滿意。相對偏差和關聯程度表明本工作模型的建立較其他模型有了較大的改善。

3 結 論

在298.15 K 的恒溫條件下：

圖4 [C2mim]BF4-NaH2PO4 雙水相中木瓜蛋白酶分配系數預測值Fig.4 Prediction of papain partition coefficient for [C2mim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

圖5 [C4mim]BF4-NaH2PO4 雙水相中木瓜蛋白酶分配 系數預測值Fig.5 Prediction of papain partition coefficient for [C4mim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

圖6 [C6mim]BF4-NaH2PO4 雙水相中木瓜蛋白酶分配 系數預測值Fig.6 Prediction of papain partition coefficient for [C6mim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

（1）利用濁點法測定雙節線，制作相圖，并用非線性Merchuk 參數方程關聯雙節線數據，擬合度均在0.975 以上，結果令人滿意；

（2）測定了 [Cnmim]BF4-NaH2PO4雙水相體系的液液相平衡數據，并用Othmer-Tobias 和Bancroft方程關聯了該數據，線性相關系數在0.994 以上，平均相對誤差在0.1%以下，結果理想；

（3）測定了木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4-NaH2PO4雙水相體系中的蛋白濃度分配系數，通過Matlab 建立了實驗模型并進行了關聯，相對偏差在5%以內，與其他模型相比關聯很理想。

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