膠原在兩種離子液體[BMIM]Cl 和[BMIM]Ac中的溶解及再生結構比較

劉潔，趙世玉，徐洲，常金明，陳意，范浩軍,2

（1 四川大學皮革化學與工程教育部重點實驗室，四川 成都 610065； 2 四川大學制革清潔技術國家工程實驗室，四川 成都 610065）

引 言

膠原作為天然的動物生物質資源，是細胞外基質的主要組成部分，同時也是動物體內含量最多、分布最廣的結構性蛋白，占體內蛋白總量的1/3 左右，而動物皮是膠原的主要原料來源。膠原種類繁多，現已證明已發現的28 類膠原至少構成了脊椎動物中46 種不同的多肽鏈[1]。膠原為生物大分子，相對分子質量約30 萬，具有由3 條呈聚脯氨酸Ⅱ型左手螺旋的平行多肽鏈相互纏繞而成的右手超螺旋結構（三股螺旋構象）[2]，這種結構賦予其特殊的生物活性，如低的免疫原性、良好的生物相容性、優良的吸濕性，能促進血小板凝結，促進細胞的存活、生長、愈合，因而膠原基新型材料如吸附材料、生物醫用材料、組織工程材料、整形和美容護膚材料、保健食品等在許多領域得到了廣泛的應用，被認為是最有用的天然生物質材料之一。

當前生皮膠原的主要用途，一是制革制膠，二是高值轉化為具有生物活性或功能特異性的膠原基新型材料。作為制備生物材料的關鍵一步，往往需要先將膠原溶解。然而膠原是天然“超分子”，其側鏈含有豐富的極性基團，故可結合自重10 倍以上的水，而本身卻不溶于水[3]。盡管有少量的溶劑，如稀醋酸溶液、三氟乙醇（TFE）、六氟異丙醇（HFIP）等，因具有捕捉氫鍵、電價鍵或破壞疏水鍵的能力，可以用來溶解膠原，但是它們仍然存在一些缺點與不足。如即使是在稀酸等良溶劑中，膠原的溶解度也較小且凝膠效應明顯，難與其他相態材料復合，更難獲得高濃度的膠原溶液（膠原溶液具有高黏度，一般可用的最高濃度為4 mg·ml-1，約0.4%）[4]。特別地，一旦溶解在TFE 或HFIP 中，膠原將會失去其獨特的三股螺旋結構，而與明膠無異[5]。而且這類氟醇溶劑飽和蒸氣壓大、易揮發、腐蝕性及毒性強。顯然，膠原在傳統溶劑中的有限溶解性，尤其是在后兩種溶劑中的變性行為，違背了其作為一種仿生材料的初衷，進而阻礙了它在紡絲、醫用生物材料、食品保健、美容化妝品等方面的高值化利用。因此，找到合適的溶劑來高效地溶解制備膠原溶液，同時又盡可能地保留其三股螺旋結構的完整性，是膠原高值轉化及利用的前提與基礎。

被視為“超分子”溶劑的離子液體(ionic liquid,IL)主要由無機或有機陰離子與一個大的電荷呈彌散性分布且高度不對稱的陽離子構成，是近年來興起的一類極具應用前景的綠色溶劑。因其可回收、高熱穩定性、可設計性、強極性以及良好的生物相容性等獨特性能，可替代傳統的揮發性有機溶劑廣泛應用于電化學、有機合成、化工分離、材料制備等領域[6-8]。特別地，離子液體的物理化學性質強烈地依賴其陰陽離子的種類以及雜環的側鏈烷基長度，因此改變這些結構參數將導致離子液體的黏度、揮發性、催化活性、疏水性和熔點等方面的顯著變化。離子液體中的陽離子可作為電子接受體，陰離子可作為強氫鍵受體，故可與膠原分子中的氧原子和氫原子相互作用，進而裂解膠原大分子間的氫鍵，近年來人們試圖利用離子液體的這種特性來高效溶解膠原。

周雅文等[9]利用1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽([AMIM]Cl)離子液體溶解脫鉻皮屑，發現溫度低于100℃時膠原纖維幾乎不溶解。由于[AMIM]Cl 很稠，影響傳質傳熱速率，發現150℃下溶解50min的溶解量最大。牛鳳英等[10]考察了[AMIM]Cl 對豬皮粉的溶解效果，發現溶解溫度高于140℃時膠原蛋白將發生嚴重的降解。本課題組[11]發現在[BMIM]Cl 中明膠、酪素、皮粉均能溶解，明膠、酪素溶解前后其結構和熱穩定性能都未發生明顯變化，而皮膠原的熱穩定性能略有下降。Meng 等[12]探討了以[BMIM]Cl 為介質在100℃的溶解條件下制備多種樣式的膠原/纖維復合材料的可行性。Wang 等[13]在100℃的條件下用[BMIM]Cl 溶解制備了膠原/纖維素水凝膠珠，因其三維孔狀結構中的氨基酸含有金屬離子的活性結合位點，可用于2 價銅離子的吸附。

前人的研究工作多停留在考察高溫下膠原的溶解性以及溶解前后其化學結構的變化，較少涉及離子液體的分子結構差異對膠原蛋白溶解性能的影響，特別是離子液體中陰離子的構造差異對膠原溶解前后空間結構（尤其是三股螺旋結構）和熱穩定性等性能的影響。本工作以氯代1-丁基-3-甲基咪唑離子液體為原料合成了1-丁基-3-甲基醋酸咪唑離子液體，并以兩者為溶劑考察了膠原在不同陰離子型咪唑離子液體中的溶解特性，采用FTIR、UV、XRD、CD 對膠原溶解前后的化學結構和空間結構進行了表征，同時對其溶解前后的熱穩定性進行了相關研究。本工作的目的旨在研究咪唑離子液體陰離子構造差異對膠原溶解行為的影響以及溶解前后膠原結構性能的變化，為在高效提取膠原溶液的同時最大程度地保留膠原固有的三股螺旋構象，提高膠原的生物活性和與其他體系的相容性奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 主要原料與儀器

（1）原料 氯代1-丁基-3-甲基咪唑：化學純（≥99%），上海成捷化學有限公司；牛皮皮粉：四川大學制革清潔技術國家工程實驗室；醋酸銨；4?分子篩：分析純，成都市科龍化工試劑廠；無水乙醇：化學純，成都金山化學試劑有限公司。

（2）儀器 SHZ-D(Ⅲ)型循環水真空泵：成都康宇科技有限公司；DZF-6020 型真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；DF-1012 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南予華儀器有限公司；RE52-1 旋轉蒸發儀：上海滬西分析儀器廠；Nicolet Is10 傅里葉紅外光譜儀：美國Thermo Scientific 公司；LAMBDA25型紫外可見分光光度計：美國PerkinElmer 公司；DX-1000 型X 射線衍射儀：中國丹東方圓儀器有限公司；Model 400 型圓二色譜儀：美國Aviv 公司；TG209F1 型熱重分析儀：德國耐馳公司。

1.2 離子液體[BMIM]Ac 的制備與表征

采用離子交換法制備醋酸鹽型離子液體[14-15]：將氯代1-丁基-3-甲基咪唑和醋酸銨按摩爾比1:1 分別溶解在無水乙醇中，將溶解好的氯代咪唑醇溶液轉移至三口燒瓶中。分批加入醋酸銨醇溶液，并在60℃油浴中加熱回流6 h，同時施以磁力攪拌，生成的NH4Cl 以白色沉淀的形式從醇溶液中析出。真空抽濾，收集濾液，用4? 分子篩處理48 h。減壓蒸餾，除去乙醇，產物為淡黃色的[BMIM]Ac 液體，密封干燥保存。合成反應為

1.3 膠原在咪唑離子液體中的溶解

[BMIM]Ac 溶解皮粉的溫度為 50 ℃，而 [BMIM]Cl 在75℃條件下對皮粉進行溶解。實驗中采用油浴加熱、磁力攪拌溶解。皮粉分多次加入，每次加入量為離子液體的1%。膠原在溶液中的溶解度（質量分數）根據公式C=m(膠原)/m(離子液體)×100%計算。

1.4 再生膠原的制備

在約4℃條件下，將膠原離子液體混合液傾倒在聚四氟乙烯板上，并用無菌玻璃推板鋪展均勻。將聚四氟乙烯板浸沒在乙醇沉淀浴中0.5 h，更換乙醇浴，前后多次，直至離子液體完全分散到沉淀浴中。然后取出聚四氟乙烯板，置于真空干燥箱中，常溫減壓干燥，得到恒重的再生膠原半透明膜。

1.5 膠原纖維及再生膠原的性能測試

（1）紅外光譜分析 對皮粉及經兩種離子液體溶解再生得到的膠原蛋白采用研片的方式制備試樣：取少量溶解前后的皮粉，按溴化鉀/檢測樣為100:1 的比例混合碾磨，壓片后進行傅里葉變換紅外光譜分析，觀察溶解前后蛋白質化學結構的變化情況。儀器分辨率為4 cm-1，掃描頻率32 s-1，波數范圍500～4000 cm-1。

（2）紫外-可見分光光度分析 將由皮塊酶法提取的膠原蛋白和離子液體溶解再生后的膠原以及明膠分別溶解在0.5 mol·L-1醋酸溶液中，配制成相同濃度的醋酸溶液。用UV-250IPC 型紫外可見分光光度計（日本）在200～500 nm 全波段掃描范圍內做紫外分析。

（3）X 射線衍射（XRD）分析 采用DX-1000型X 射線衍射儀測定皮粉溶解前后的XRD 譜。以CuKα為射線源，管電壓40 kV，管電流30 mA，掃描速率為1(°)·min-1，角度掃描范圍5°～50°。

（4）圓二色譜（CD）測定 將由此皮粉提取的酶溶性膠原及離子液體溶解再生膠原溶于醋酸溶液中，配置成質量濃度為0.1 mg·ml-1的膠原溶液，并于4℃平衡12 h 后，以9000 r·min-1冷凍離心20 min。取上清液加入比色皿中，放入圓二色譜儀中，于190～250 nm 范圍進行掃描。

1.6 溶解前后膠原的熱重分析

分別取3～4 mg 溶解前后的皮膠原進行熱重分析。實驗采取靜態TGA 的模式進行，測試樣在氮氣保護氣氛下，從40～600℃，以10℃·min-1的速率升溫。對得到的TGA 實驗數據進行處理，得到膠原蛋白的TGA 和DTG 曲線。

1.7 離子液體的回收

將溶有離子液體的乙醇沉淀浴抽濾，收集濾液，置于旋轉蒸發儀上，旋蒸濃縮至燒瓶中不再有氣泡產生為止，隨后將溶液置于真空干燥箱中，于90℃下干燥過夜。將回收得到的[BMIM]Cl 及[BMIM]Ac 進行紅外光譜表征，考察回收前后離子液體在結構上是否發生變化。

2 結果與討論

2.1 離子液體FTIR 紅外光譜分析

由圖1可知：3424 cm-1吸收峰對應著—OH 的伸縮振動，是水的雜質峰，因離子液體很容易吸潮。在含有咪唑陽離子的離子液體中，3100 cm-1左右的特征譜帶是由咪唑環上C—H 的伸縮振動引起的；2960、2870、1400 cm-1左右的特征譜帶分別歸屬于甲基上C—H 的反對稱伸縮振動、對稱伸縮振動和彎曲振動，2936、1460 cm-1左右的特征譜帶則分別歸屬于亞甲基上C—H 的反對稱伸縮振動和彎曲振動；1627、1570 cm-1左右的特征譜帶分別歸屬為咪唑環中及的伸縮振動，1170 cm-1左右的峰歸屬為咪唑的H—C—C 和H—C—N 的彎曲振動[16-17]；846、750、620 cm-1左右的譜帶分別歸屬于咪唑的面內、面外及其C—N—C 的彎曲振動；1012、750 cm-1左右的特征譜帶屬于C—N 的伸縮振動。[BMIM]Ac 的羧基COO-系具有多電子π鍵體系，原羰基和C—O 平均化，兩個C—O 強烈振動偶合出現了分離的對稱伸縮振動（在1400 cm-1附近）和反對稱伸縮振動（在1550～1650 cm-1區域），而在1700 cm-1附近的伸縮振動峰減弱[18]。

圖1 [BMIM]Cl 和 [BMIM]Ac 的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of [BMIM]Cl and [BMIM]Ac

2.2 不同膠原溶液的凝膠性能

圖2列出了兩種離子液體、膠原醋酸溶液及膠原在咪唑離子液體中溶解后的凝膠性能比較。一般而言，低熔點離子液體的陽離子具有以下特征：低對稱性、弱的分子間作用力和陽離子電荷的均勻分布。也就是說，陽離子中電荷越分散，分子的對稱性越低，生成化合物的熔點越低[19]。本研究中的1-丁基-3-甲基咪唑為非對稱N,N-二烷基咪唑陽離子，電荷彌散性分布，熔點較低。在陽離子相同的情況下，陰離子對離子液體的熔點也有較大影響。大的陰離子與陽離子作用力小，易生成熔點低的化合物。相對Cl-來說，CH3COO-有更大的離子尺寸，因而[BMIM]Ac 具有更低的熔點。概括來講，離子液體的熔點代表液體間隙的最低極限，其與熱穩定性一起確定了溫度間隔，進而使離子液體作為溶劑成為 可能。顯然，[BMIM]Ac 較低的熔點為其在低溫溶解膠原纖維提供了可能。

圖2 [BMIM]Cl、[BMIM]Ac、1%膠原醋酸溶液、4%膠原-[BMIM]Ac 混合液和3%膠原-[BMIM]Cl 混合液Fig.2 Appearance of [BMIM]Cl,[BMIM]Ac,1% collagen acetic acid solution,4% collagen-[BMIM]Ac solution and 3% collagen-[BMIM]Cl solution

如圖2(a)所示，[BMIM]Cl 在室溫下為白色固狀，熔點為70℃，而且易吸潮。而圖2(b)為合成的[BMIM]Ac，室溫下為液態，顏色淡黃，溶液清澈透明，黏度小。圖2(c)為室溫下1%膠原醋酸溶液，展現出高的黏稠性及凝膠狀態。考慮到醋酸為弱電解質，部分解離的Ac-與H+僅能破壞膠原分子間少量的氫鍵與電價鍵，大部分膠原分子仍然通過氫鍵聚集，因此低固含量下便呈現高黏性的凝膠狀態。然而離子液體由完全離子化的[BMIM]+、Ac-（Cl-）構成，分別作為電子的受體與質子強烈的受體。這些大量離子化的[BMIM]+、Ac-（Cl-）不僅破壞了毗鄰膠原分子間的電價鍵，而且同時破壞了分子間的氫鍵鍵合作用，導致膠原在其中具有更高的溶解度，在高固含量時仍具有良好的流動性[圖2(d)、(e)]。

2.3 膠原纖維偏光顯微分析（POM）

膠原的三股螺旋結構主要靠鏈內及鏈間氫鍵、離子鍵、范德華力、極性及非極性基團間的疏水作用來維持穩定。膠原特有的Gly-X-Y 三肽高度重復性序列導致螺旋內外存在大量的氫鍵，促成膠原纖維規整性排列，進而具備一定的類結晶結構。由于原膠原分子的定向排布，膠原纖維結構表現出明顯的各向異性，具有在長軸的雙折射性，而以Ⅰ型膠原分子為基本結構的真皮層纖維有序體有著介于各向異性晶體和各向同性液體之間的近似液晶態結構，其對齊的膠原束類似分子相排列[20-21]。

雙折射是晶體的基本特征，偏光顯微鏡觀察是利用光的偏振特性對具有雙折射性物質進行研究鑒定的必備手段。如圖3所示，皮纖維顯現出亮度較高的纖維狀，而剛浸沒于離子液體中的膠原纖維存在大片結晶光亮區，表明膠原蛋白分子間錯疊的有序結構。但當體系受熱溫度上升時，離子液體開始滲入到纖維內部，膠原分子間的氫鍵、離子鍵遭到離子液體陰陽離子的進攻而瓦解，導致膠原分子無規則地分布在離子液體中，得到各向同性的分散結構，膠原纖維的雙折射減小乃至全消失。

圖3 膠原纖維(a)、浸沒于[BMIM]Ac 中的膠原纖維(b)和膠原被[BMIM]Ac 溶解后的離子混合液(c)Fig.3 POM images (×100) of collagen fibers (a),collagen fibers immersed in [BMIM]Ac (b)，and collagen/IL mixture after dissolution by [BMIM]Ac (c)

2.4 膠原溶解前后結構的變化

2.4.1 膠原再生前后的紅外光譜分析 如圖4所示，1658 cm-1處為膠原酰胺Ⅰ帶的伸縮振動強峰，1553 cm-1處為酰胺Ⅱ帶N—H 彎曲振動吸收峰，1240 cm-1處則出現酰胺Ⅲ帶N—H 的變形峰。酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶是膠原纖維的特征吸收峰。與皮膠原相比，再生后的膠原在3 個酰胺帶也均有吸收峰，而且峰位幾乎沒有變化，譜圖中并沒有新的特征峰出現，表明無論是用[BMIM]Ac 還是[BMIM]Cl 溶解膠原都沒有造成膠原一級結構的破壞。

圖4 皮膠原(a)、[BMIM]Ac 溶解皮纖維后的再生膠原(b)和[BMIM]Cl 溶解皮纖維后的再生膠原(c)的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of native collagen (a),and collagen regenerated from different ionic liquids （b:[BMIM]Ac; c:[BMIM]Cl）

完整的膠原應具有特殊的三股螺旋結構，酰胺Ⅲ帶與1450 cm-1處吸光度的比值常用來衡量膠原的三股螺旋結構是否完整。據報道完整三股螺旋構象的膠原應該Ⅰ1240/1450≥1（圖4中譜線a)[22]。當溶解溫度為50℃時，[BMIM]Ac 溶解再生后的膠原Ⅰ1240/1450值降到0.93 左右，而75℃下[BMIM]Cl 溶解再生后的膠原Ⅰ1240/1450值則明顯降低至0.83，表明溶解溫度升高膠原三股螺旋結構受損程度也隨之增大，但相比于膠原的水解產物明膠（約0.6）[23]，此時的膠原依然維持較高的結構完整性，說明兩種離子液體溶解再生后的膠原三股螺旋結構被破壞的程度不高。

2.4.2 膠原溶解前后的紫外光譜分析 膠原的肽鏈中含有眾多生色基團，可以在近紫外區檢測到吸收峰。圖5是膠原溶解前后的UV 譜圖。

圖5 皮膠原(a)、[BMIM]Ac 溶解再生膠原(b)、[BMIM]Cl溶解再生膠原(c)和明膠（d）的紫外吸收光譜圖Fig.5 UV spectra of solutions of native collagen (a),collagen regenerated from different ionic liquids(b:[BMIM]Ac; c:[BMIM]Cl),and gelatin (d)

由圖5中譜線a 可知，膠原蛋白的紫外最大吸 收波長為233 nm，這是膠原蛋白肽鏈中、COOH、CONH2產生的吸收峰，是膠原蛋白的特征峰[10]。無論是膠原蛋白還是再生后的膠原，其最大吸收波長都出現在233 nm 附近處，峰型相似，表明經咪唑離子液體溶解的膠原一級結構保留較好，沒有遭到明顯的破壞。280 nm 為酪氨酸、苯丙氨酸的吸收峰，峰的強弱與膠原蛋白溶液的濃度存在一定關系。如圖5中譜線a、b、c 所示，膠原蛋白及溶解再生后的膠原蛋白280 nm 處的峰不明顯。對于同樣濃度的明膠溶液來說，280 nm 處的峰明顯強于其他膠原溶液，原因可能在于明膠是膠原嚴重水解的產物，膠原的三股螺旋結構已基本喪失殆盡，而且膠原分子鏈在水解過程中被打斷，使得大量包裹在分子鏈內部的酪氨酸、苯丙氨酸殘基暴露出來，導致280 nm 處的吸收峰明顯增強。膠原及再生膠原的紫外圖譜說明，即使是在75℃的條件下用[BMIM]Cl 溶解膠原，膠原仍保留一定的有序結構，破壞程度小于明膠。

2.4.3 膠原溶解前后的XRD 分析 X 射線衍射是測定膠原空間結構、理解膠原分子三股螺旋構象和膠原原纖維軸向排列方式的物理方法。圖6是膠原溶解前后的XRD 衍射譜圖。

圖6 皮膠原(a)、[BMIM]Ac 溶解再生膠原(b)和[BMIM]Cl溶解再生膠原(c)的XRD 衍射譜圖Fig.6 XRD patterns of native collagen fibers (a) and collagen regenerated from IL (b:[BMIM]Ac; c:[BMIM]Cl)

由圖6可以看出，天然皮膠原（皮粉）的X 射線衍射圖上主要有3 個衍射峰：第一個是在2θ為7°～8°（約1.3 nm）處，為晶區產生的衍射峰，這種布拉格間距代表的是組成膠原纖維的分子鏈間橫向距離；第二個是在2θ=22°附近，出現一個非常寬的峰，為膠原纖維內部眾多結構層次引起的漫散射；第三個在2θ=31°（約0.29 nm）附近，有一個小而寬的峰，反映的是膠原螺旋的一個旋轉高度內所對應的軸向周期，即典型的三股螺旋結構[24-26]。可以看出，再生膠原與天然皮膠原纖維的XRD 衍射譜圖形狀相似，但再生膠原在2θ=8°～9°處的衍射峰發生左移，表明膠原分子鏈間距變大，膠原在溶解過程中分子鏈彼此分散。[BMIM]Cl 溶解再生膠原在此峰處變寬變小，可能是過高的溶解溫度使得部分膠原分子鏈發生了解螺旋，導致結晶度下降。

2.4.4 膠原溶解前后的圓二色譜 圓二色譜（CD）是研究稀溶液中蛋白質空間結構的一種方法，主要利用分子對左、右圓偏振光吸收的不同進行結構分析。膠原由具有光學活性的α-氨基酸通過肽鍵連接而成，是具有特定結構的生物大分子，其圓二色性主要是活性生色基團及折疊結構兩方面圓二色性的總和。由于膠原是一類光學活性蛋白質，采取類聚脯氨酸Ⅱ型的螺旋構象，其圓二色譜特征就是在200 nm 附近有一個負吸收峰，而在223 nm 左右有一個弱的正吸收峰。

圖7 皮膠原(a)、[BMIM]Ac 溶解再生膠原(b)和[BMIM]Cl溶解再生膠原(c)的圓二色譜圖Fig.7 CD spectra of native collagen (a) and collagen regenerated from different ionic liquids (b:[BMIM]Ac; c:[BMIM]Cl)

由圖7可知，膠原及再生膠原都具有典型的膠原圓二色譜特征。但是有研究顯示[27]，膠原完全變性后223 nm 處的正吸收峰完全消失，如膠原的水解物明膠。另有研究表明[28]，膠原螺旋結構的改變將導致CD 圖譜中峰強度的降低，并且在長波長處（約223 nm）出現的峰強度與在短波長處（約200 nm）出現的峰強度比值（Rpn）會降低。膠原在[BMIM]Ac 溶解再生后的Rpn值由原來的0.152 降到了0.127，說明再生膠原三股螺旋的完整性稍有所降低，但是[BMIM]Cl 溶解再生后的膠原Rpn 值減少到0.05，說明75℃下加熱溶解后的膠原三股螺旋結構發生部分解構，顯然更高的溶解溫度不利于膠原三股螺旋構象的保留。

2.5 膠原再生前后的熱穩定性研究

圖8 皮膠原(a)、[BMIM]Ac 溶解再生膠原(b)和[BMIM]Cl 溶解再生膠原(c)的TG/DTG 曲線Fig.8 TG/DTG curves of native collagen (a) and collagen regenerated from different ionic liquids (b:[BMIM]Ac; c:[BMIM]Cl)

一般而言，大分子的熱穩定性取決于其分子量、空間結構、分子間作用力等因素。從圖8可知，膠原的熱失重主要分為兩個主要階段：40～150℃為膠原分子間及分子內氫鍵的斷裂，同時伴隨著水分的蒸發；200～500℃則是膠原多肽鏈的熱分解階段[29]。事實上，膠原纖維、[BMIM]Ac 及[BMIM]Cl溶解再生膠原15%的質量損失溫度分別發生在290、281 和253℃，表明再生膠原的熱穩定性低于原膠原纖維。由于離子液體溶解膠原主要依靠打斷膠原分子間氫鍵及離子鍵的作用力，但是在溶解過程中不可避免地導致了少量分子內氫鍵的破壞，造成再生膠原在低溫區域熱穩定的相應下降，特別是[BMIM]Cl 中較高的溶解溫度在一定程度上導致了膠原纖維的部分熱降解。

2.6 溶解機理

膠原分子的螺旋構象以及維持構象的各種分子間作用力賦予膠原纖維不溶的性質。離子液體能夠溶解膠原的機理可能主要在于其能夠破壞膠原大分子間的氫鍵及離子鍵，目前可以推斷的是膠原分子上的氧和氫原子與離子液體中的陰陽離子基團間發生了相互作用。如圖9所示，在溶解溫度下，離子液體中的陰陽離子對首先解離為自由的[BMIM]+和陰離子，然后這些游離的CH3COO-或Cl-與膠原肽鍵中—NH—上的H 配合，而[BMIM]+與膠原的肽鍵結合。同時由于靜電力的作用，帶有相反電荷的[BMIM]+、Ac-（Cl-）分別與膠原側鏈離子化的COO-與NH+3相互吸引鍵合，破壞了COO-與NH+3間原有的電價鍵。[BMIM]+、Ac-（Cl-）與膠原分子間新形成的氫鍵與離子鍵打斷了膠原分子間 的氫鍵及離子鍵，最終導致膠原鏈能夠自由地運動并溶解于離子液體中。

圖9 膠原纖維在咪唑離子液體中的溶解原理Fig.9 Possible dissolution mechanism of collagen in imidazolium ionic liquids

相較于[BMIM]Cl，[BMIM]Ac 溶解膠原纖維的條件溫和得多，這不僅由于醋酸鹽的咪唑離子液體有著更低的熔點及黏度，還在于其有著更強的質子接受能力。有研究表明，Kamlet-Taftβ參數可作為反映溶劑質子接受能力的參數。一般而言，溶劑的β參數越大，其接受質子的能力就越強。很明顯，陽離子相同的離子液體，其接受氫鍵的能力（β參數值）隨陰離子不同而不同。根據先前的研究，由于醋酸根的存在，[BMIM]Ac 的β參數值為1.2，幾乎是[BMIM]Cl（β=0.83）的1.5 倍左右[30]。因此，[BMIM]Ac 展現出更強的質子接受能力，能夠破壞膠原聚集體分子間廣泛且有序組織存在的大量氫鍵，進而導致膠原在更低的溫度下溶解，避免了膠原的三股螺旋在受熱溶解過程中的解構。此外，當[BMIM]Ac 滲透到膠原纖維間隙內時，其較大的陰陽離子空間體積降低了膠原分子的內聚作用（削弱、破壞化學鍵）并增加了其親溶劑性，因而所制備的膠原溶液具有更高的固含量和流動性。

2.7 離子液體回收前后的紅外光譜分析

離子液體能夠回收與再利用是其主要優點之一，這樣離子液體就可以循環使用，從而降低生產成本。離子液體的沸點較高、熱穩定性好、飽和蒸氣壓接近零，因而沉淀浴中的離子液體和乙醇可以通過減壓蒸餾操作進行分離。本研究對回收后的[BMIM]Cl 及[BMIM]Ac 進行了紅外光譜表征，考察回收前后離子液體在結構上是否發生變化。由圖10可知，除3424 cm-1附近處水的雜質峰變寬外（可能原因在于皮膠原溶解過程中帶入的一部分結合水在蒸餾過程中沒有除盡），離子液體回收前后的紅外譜圖基本一致。這說明回收后的離子液體仍然保持其原有的結構，可以重復利用。

圖10 [BMIM]Cl(a)、回收后的[BMIM]Cl(b)、[BMIM]Ac(c)和回收后的[BMIM]Ac(d)的紅外光譜圖Fig.10 FTIR spectra of [BMIM]Cl (a),recovered [BMIM]Cl (b),[BMIM]Ac (c),and recovered [BMIM]Ac (d)

3 結 論

（1）合成的1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽離子液體（[BMIM]Ac）與咪唑氯鹽[BMIM]Cl 相比，具有常溫流動性好、黏度低和氫鍵接受能力強等特點，離子液體所制備的膠原溶液具有更高的固含量和良好的流動性。

（2）POM 觀察顯示膠原的晶態結構在離子液體溶解過程中的變化。離子液體破壞了膠原分子間的氫鍵，導致以氫鍵作用為基礎堆疊形成的結晶構象瓦解，溶解后的膠原晶態結構被破壞（亮區完全消失），分子無規則地散布于離子液體中。

（3）膠原在咪唑離子液體中的溶解與再生過程并沒有導致其紅外、紫外譜圖的明顯變化，表明膠原的化學結構沒有改變，其溶解屬于直接溶解，溶解機理為構成離子液體的陰、陽離子削弱了膠原分子間的氫鍵及離子鍵作用。

（4）FTIR、XRD、CD 分析表明，離子液體溶解再生后的膠原三股螺旋結構發生部分松散，但在相同咪唑陽離子的情形下，由于Ac-具有更強的質子接受能力以及更大的離子尺寸所帶來的更低熔點與溶解溫度，經[BMIM]Ac 溶解再生后的膠原三股螺旋結構保留相對完整，螺旋保留度遠高于[BMIM]Cl 溶解再生的膠原。

（5）熱重分析表明再生后的膠原熱分解溫度和熱解峰均低于天然膠原纖維，原因在于皮膠原在溶解過程中部分空間結構和聚集態發生了改變，特別是[BMIM]Cl 過高的溶解溫度可能導致膠原的部分解螺旋，相較于氯代咪唑鹽，醋酸咪唑鹽溶解再生的膠原具有更高的熱穩定性。

（6）回收后的[BMIM]Cl 及[BMIM]Ac 結構沒有發生明顯變化，仍可繼續使用，降低了反應成本。

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