地拉羅斯聯(lián)合順鉑對非小細胞肺癌細胞增殖及凋亡的影響

袁婷，梁吉祥，張斌，汪蓓蕾，張欣，郭剛，張瑞△

地拉羅斯聯(lián)合順鉑對非小細胞肺癌細胞增殖及凋亡的影響

袁婷1，梁吉祥2，張斌1，汪蓓蕾1，張欣1，郭剛1，張瑞1△

目的探討鐵鰲合劑地拉羅斯及其聯(lián)合順鉑對肺腺癌A549細胞增殖、凋亡的影響，為尋找肺癌有效的治療途徑提供依據(jù)。方法常規(guī)傳代細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)肺腺癌細胞A549，以不同濃度的地拉羅斯、地拉羅斯聯(lián)合順鉑干預(yù)細胞生長一定時間。在倒置顯微鏡下觀察A549的生長抑制特征；MTT法檢測細胞的增殖抑制狀況；DAPI、AO/ EB染色觀察細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；Annxin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)定量測定細胞凋亡狀況。結(jié)果A549細胞經(jīng)不同濃度的藥物作用一定時間以后，在倒置顯微鏡下可見隨藥物濃度和時間的增加，細胞數(shù)明顯減少，細胞相互分散，貼壁細胞出現(xiàn)皺縮變小折光性差；MTT檢測顯示，細胞增殖抑制率隨藥物濃度的增加和作用時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢，即劑量效應(yīng)關(guān)系及時間效應(yīng)關(guān)系；DAPI、AO/EB染色法觀察到細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，即細胞發(fā)生染色質(zhì)凝集，核固縮等典型的凋亡形態(tài)特征；流式細胞術(shù)檢測顯示，細胞的凋亡率隨藥物濃度的增加而升高，聯(lián)合用藥促細胞凋亡顯著。結(jié)論鐵鰲合劑地拉羅斯具有抗肺癌細胞A549增殖的能力，促進腫瘤細胞凋亡，其與順鉑聯(lián)合可增強癌細胞耐受性，降低順鉑的用量及其不良反應(yīng)。

癌，非小細胞肺；鐵螯合劑；順鉑；細胞增殖；細胞凋亡；地拉羅斯

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，已經(jīng)成為人類因癌癥死亡的主要原因之一。肺癌分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中非

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞，購自中科院上海細胞生物研究所，本實驗室常規(guī)傳代培養(yǎng)。RPMI-1640、胎牛血清（FBS）、青霉素、鏈霉素均購自Gibco公司；胰蛋白酶、MTT購自Sigma公司；Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒購自Jacson公司；吖啶橙（Acridine orange，AO）和溴乙啶（ethidium bromide，EB）購自Amresco公司；細胞培養(yǎng)板、離心管、培養(yǎng)瓶等購自Corning公司。熒光倒置顯微鏡（德國Lei?ca，4000B型），普通光學(xué)顯微鏡（德國Leica，520804型），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國熱電公司產(chǎn)品），酶標檢測儀（德國Beck?man），流式細胞儀（美國BD公司），超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），離心機（德國HERMLE，Z300型）。

1.2方法

1.2.1A549細胞復(fù)蘇從液氮罐中取出A549細胞凍存管，直接投入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化，待凍存液完全溶解后，乙醇消毒凍存管，用吸管吸出細胞懸液，注入10 mL離心管中，再加入9 mL 10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，離心、去上清，再用培養(yǎng)液洗1次，棄上清，加入5 mL培養(yǎng)液，輕輕吹打離散細胞，移入25 mL培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液。

1.2.2A549細胞傳代及細胞培養(yǎng)選擇生長狀態(tài)良好，細胞貼壁融合達70%～80%的細胞進行傳代，棄去舊培養(yǎng)基，用0.01 mol/L PBS液清洗2次，加入0.25%胰酶消化液1 mL，置顯微鏡下觀察，當細胞回縮，間隙增大后加入含體積分數(shù)10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕地將細胞吹打下來，離心、去上清、重懸細胞使之成為單細胞懸液，細胞計數(shù)，之后將細胞懸液分成等份分裝數(shù)個培養(yǎng)瓶，補加培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次，待細胞融合成致密單層后可再次傳代。

1.2.3A549細胞計數(shù)臺盼藍染料排除法：用95%乙醇清洗擦凈計數(shù)板和蓋片，自然風(fēng)干，將蓋片置于計數(shù)板上面，微露一側(cè)計數(shù)板臺面，9滴細胞懸液和0.4%臺盼藍燃料1滴混勻，置2～3 min后取1滴輕輕滴入計數(shù)板邊緣，使之充滿計數(shù)板和蓋片間隙，立即鏡檢：健康細胞透明不著色。計4個大方格內(nèi)的健康細胞數(shù)，按以下公式計算細胞懸液濃度，每一樣品重復(fù)計數(shù)3次，取均值。每毫升細胞數(shù)=4大格細胞總數(shù)/4×104。

1.2.4A549細胞凍存選擇生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞，凍存前1 d換液1次。胰酶消化收集細胞，制成單細胞懸液，將細胞懸液移至離心管中，室溫下1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入3 mL PBS，吸管吹打混勻，室溫下1 000 r/ min離心5 min，棄上清，加入細胞凍存液，使細胞的最終密度為5×106/mL，吹打混勻，移入凍存管，封口，注明凍存細胞名稱、凍存日期。凍存細胞依次置于4℃30 min，20℃l h，80℃過夜，液氮罐中長期保存。

1.2.5A549細胞生長抑制的形態(tài)學(xué)觀察取對數(shù)生長期的A549細胞，用0.25%胰酶消化液消化，加入含體積分數(shù)10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕地將細胞吹打下來，離心、去上清、重懸細胞配制成密度為1×105個/mL的單細胞懸液，均勻鋪到6孔板中，孵育過夜，倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁后，分別加入終濃度為20、40、80、160、320 μmol/ L地拉羅斯，加或不加順鉑（終濃度8 μmol/L）的培養(yǎng)液，對照組用含體積分數(shù)10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基同步培養(yǎng)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h、48 h后，置于倒置顯微鏡下動態(tài)性及對照性地觀察細胞。

1.2.6MTT法測定A549細胞的增殖抑制率取對數(shù)生長期的A549細胞，以1×105個/mL細胞密度接種96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，置體積分數(shù)為5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞貼壁后，實驗組分別加入終濃度為20、40、80、160、320 μmol/L地拉羅斯，加或不加順鉑（終濃度8 μmol/L）的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，對照組用含體積分數(shù)10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基同步培養(yǎng)，以上每孔均設(shè)置4個平行復(fù)孔。藥物作用指定時間以后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL的DMSO，震蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，采用酶標儀在490 nm波長處測定各孔的光密度（OD）值，取每4個重復(fù)孔OD值的平均數(shù)，按下列公式求出藥物對腫瘤細胞的抑制率。細胞存活率=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。

1.2.7DAPI、AO/EB染色觀察A549細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化DAPI染色：取對數(shù)生長期的A549細胞，以1×105個/mL細胞密度接種于6孔板中，每孔加入2 mL培養(yǎng)液，置體積分數(shù)為5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，分別加入終濃度為20、40、80、160、320 μmol/L地拉羅斯、加或不加順鉑（終濃度8 μmol/L）的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸棄培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛溫室固定1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，再用DAPI染液溫室避光染色30 min，吸棄染液，PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察，拍照。AO/PI染色：同上方法培養(yǎng)處理細胞48 h后棄去培養(yǎng)液，加入AO/EB染液溫室避光染色15 min，吸棄染液，PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.8A549細胞凋亡的測定取對數(shù)生長期的A549細胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板中，孵育過夜，細胞貼壁后，分別加入不同濃度的地拉羅斯、加或不加順鉑的培養(yǎng)液，對照組加入等體積的生理鹽水，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細胞1×106個，離心、棄上清，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，離心、棄上清，用1×結(jié)合緩沖液重懸細胞使其濃度為1×106/mL，加入5 μL Annexin V/FITC和10 μL PI染色液（20 mg/L）避光反應(yīng)5 min，BDFACS Aria流式細胞儀檢測分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件計算平均值和標準差，用SPSS 13.0軟件進行多組間方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1地拉羅斯對A549細胞生長抑制的形態(tài)學(xué)影響培養(yǎng)24 h、48 h的A549細胞，對照組細胞連接緊密，密集成片生長，形態(tài)大小均勻，折光性好。經(jīng)不同濃度的藥物處理后，可見細胞數(shù)明顯減少，細胞相互分散，貼壁細胞出現(xiàn)皺縮變小，固縮且深染，折光性差。隨著濃度的增加和作用時間的延長，漂浮細胞增多，貼壁生長的細胞變得稀疏，見圖1、2。

Fig.1　Morphological effects of drugs after 24 h of cell growth inhibition（HE，×100）圖1　藥物作用24 h后細胞生長抑制的形態(tài)學(xué)影響（HE，×100）

2.2地拉羅斯對A549細胞增殖的影響地拉羅斯在24 h處理組20 μmol/L時，對細胞的抑制作用不明顯，48 h、72 h處理組與對照組相比，各濃度均顯示出明顯的生長抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨給藥時間的延長，藥物對細胞抑制作用也越來越強，320 μmol/L地拉羅斯聯(lián)合順鉑作用48 h，細胞抑制率已達到65%，160 μmol/L地拉羅斯聯(lián)合順鉑抑制率也達到47%，80 μmol/L地拉羅斯聯(lián)合順鉑組作用細胞72 h，細胞抑制率接近50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

Fig.2　Morphological effects of drugs after 48 h of cell growth inhibition（HE，×100）圖2　藥物作用48 h后細胞生長抑制的形態(tài)學(xué)影響（HE，×100）

Fig.3　The impact of drugs on A549 cell proliferation圖3　藥物對A549細胞增殖的影響

2.3地拉羅斯對A549凋亡的形態(tài)學(xué)觀察正常細胞核被染成均一的淡藍色，核完整性良好，而藥物處理后部分細胞發(fā)生染色質(zhì)凝集，核固縮等典型的凋亡形態(tài)特征，在熒光顯微鏡下細胞核內(nèi)呈現(xiàn)亮藍色斑點，并隨藥物濃度的增大，發(fā)生核固縮現(xiàn)象的細胞數(shù)量相應(yīng)增多，且聯(lián)合用藥組現(xiàn)象更明顯，以160μmol/L的地拉羅斯或聯(lián)合順鉑處理時，凋亡細胞數(shù)量明顯增多；AO/EB染色進一步觀察顯示，對照組細胞核完整，呈均勻的綠色熒光，而處理組細胞膜邊緣粗糙，細胞核邊集、濃縮等變化，呈不均勻的亮綠色熒光。以160 μmol/L的地拉羅斯或80 μmol/L地拉羅斯聯(lián)合順鉑處理細胞48 h后，可見細胞部分已經(jīng)處于凋亡晚期，細胞膜完整性被破壞，細胞核被染成橘紅色，見圖4、5。

Fig.4 Effect of Deferasirox on apoptotic morphology of A549圖4　地拉羅斯對A549細胞凋亡的形態(tài)學(xué)影響（×200）

Fig.5　Effect of combination of Deferasirox with cisplatinon on apoptotic morphology of A549圖5　地拉羅斯聯(lián)合順鉑對A549細胞凋亡的形態(tài)學(xué)影響（×200）

2.4Annxin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)定量測定細胞凋亡A549細胞凋亡率隨藥物處理劑量的增大而增加，160 μmol/L地拉羅斯處理A549細胞48 h 或80 μmol/L地拉羅斯聯(lián)合順鉑處理48 h時，凋亡率顯著增加，見圖6。

Fig.6　The impact of drugs on the rate of apoptosis in A549 cell圖6　藥物對A549細胞凋亡率的影響

3　討論

肺癌細胞具有高侵襲、高轉(zhuǎn)移等復(fù)雜的生物學(xué)特性，其惡性程度比較高。在國際上肺癌的發(fā)病率和死亡率是增長最快的惡性腫瘤。所以如何有效阻斷癌細胞的增殖，抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)成為世界性的抗癌焦點。雖然近年來隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人類對肺癌的研究、治療已取得進展，治療肺癌的藥物也已用于臨床，但是療效均無實質(zhì)性突破。

鐵是各種生命細胞增殖和功能活動所需的必要元素之一［6］。腫瘤細胞更需要攝取足量的鐵以供其自身生長、分化及增殖，其需鐵量顯著高于正常細胞。國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)：鐵超載可促進腫瘤細胞的生長，而鐵剝奪可抑制腫瘤細胞的生長［7-9］。肺腺癌細胞也屬腫瘤細胞，其增殖也需大量的鐵，而應(yīng)用鐵鰲合劑造成鐵缺乏對肺癌細胞也有一定的影響。然而目前用于臨床的鐵鰲合劑如去鐵胺等治療肺癌的藥物，存在半衰期短，患者順應(yīng)性差，不良反應(yīng)較大等缺陷。本研究利用另一種高效口服的鐵鰲合劑—地拉羅斯，作用于肺腺癌細胞來觀察其對細胞增殖凋亡的影響，為肺癌的治療、研究提供理論依據(jù)。

為研究A549細胞的生長狀況以了解地拉羅斯和地拉羅斯聯(lián)合化療藥物對肺腺癌細胞增殖抑制的作用，本實驗采用兩種手段即形態(tài)學(xué)觀察、細胞增殖活力（MTT）法來反映藥物對A549的抑制作用。本研究利用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)正常細胞連接緊密，密集成片生長，形態(tài)大小均勻。經(jīng)不同濃度的地拉羅斯或聯(lián)合順鉑作用后，可見細胞數(shù)目減少，細胞形態(tài)發(fā)生變化，折光性差，隨著藥物濃度的增加以及作用時間的延長，漂浮細胞增多，貼壁生長的細胞變得稀疏，并且地拉羅斯聯(lián)合順鉑處理后，細胞生長抑制作用更明顯。MTT法檢測地拉羅斯及聯(lián)合順鉑對A549細胞增殖抑制率的影響，結(jié)果顯示，隨藥物濃度的增加和作用時間的延長，細胞的增殖抑制率升高，地拉羅斯為160μmol/L作用48 h時抑制率已達到50%左右，且聯(lián)合用藥抑制率更高。另外，通過查文獻顯示順鉑的半數(shù)致死濃度為12μmol/L，而本實驗采用的順鉑終濃度為8 μmol/L。以上表明地拉羅斯對A549細胞的增殖有較強的抑制作用，聯(lián)合化療藥物效果更好，并且可以降低化療藥物的使用濃度，增強癌細胞耐受性。

細胞凋亡是機體維持自身穩(wěn)定和平衡的一種重要機制，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡抑制密切相關(guān)［10］。誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡在癌癥的治療中具有重要作用，是許多藥物抑制腫瘤細胞生長的機制之一［11-12］。為了研究地拉羅斯對腫瘤細胞的生長抑制作用是否通過誘導(dǎo)其凋亡實現(xiàn)，本實驗采用DAPI和AO/EB熒光染色、Annexin-V/PI雙染流式細胞術(shù)來對A549細胞從形態(tài)學(xué)和生化特征兩個方面進行凋亡特征檢測。DAPI和AO/EB熒光染色法顯示對照組細胞核均勻淡染，而藥物處理組細胞部分出現(xiàn)染色質(zhì)凝集，核固縮為新月狀、念珠狀，呈現(xiàn)亮藍色或亮綠色熒光，從形態(tài)學(xué)方面證實地拉羅斯誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生。Annexin-V/PI雙染流式細胞術(shù)檢測顯示，隨藥物濃度的增加，細胞凋亡率逐漸上升，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性關(guān)系。

綜上所述，本實驗利用形態(tài)學(xué)觀察、MTT法、流式細胞術(shù)等生物學(xué)指標，證實了鐵鰲合劑地拉羅斯及其聯(lián)合順鉑對非小細胞肺癌增殖、凋亡的作用，即抗增殖、促凋亡作用，地拉羅斯單藥或聯(lián)合其他化療藥物應(yīng)用可能是治療肺癌的一個可行的途徑，為臨床采用地拉羅斯或聯(lián)合地拉羅斯治療研究非小細胞肺癌提供了實驗基礎(chǔ)。

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（2014-04-30收稿2014-09-25修回）

（本文編輯魏杰）

The effect of combination treatment using iron chelator deferasirox and cisplatin on proliferation and apoptosis in non-small cell lung cancer

YUAN Ting1，LIANG Jixiang2，ZHANG Bin1，WANG Beilei1，ZHANG Xin1，GUO Gang1，ZHANG Rui1△
1 Institute of Endocrinology/Metabolic Disease Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 The Second Hospital of Tianjin Medical University
△Corresponding Author E-mail：bbrui2003@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the combination effect using iron chelators deferasirox and cisplatin on A549 cell proliferation and apoptosis and to provide evidences to explore an effective way to treat lung cancer.MethodsLung adeno?carcinoma cells were cultured by conventional way，with administration of different concentrations of deferasirox and cisplat?in.Cell growth inhibition was observed under an inverted microscope.Proliferation inhibition was evaluated by MTT assay. Morphological changes of cell apoptosis was detected using DAPI，AO/EB straning and flow cytometry.ResultsAfter a cer?tain time of incubation with different concentrations of the combined drugs，the cell number reduce significantly，which was counted under invert microscope.Cells were dispersed with each other and adherent cells appear shrunken and poor in re?fractivity.MTT assay showed that inhibition of cell proliferation was in a concentration-time-dependent manner.Chromatin condensation，nuclear condensation and other typical apoptotic morphology were detected after DAPI and AO/EB straning. Flow cytometry showed that apoptosis increased with rising drug concentration.So combination therapy was significantly pro-apoptotic.ConclusionDeferasirox has the ability to inhibit proliferation of A549 cells and can promote tumor cell apoptosis and enhances cancer cell tolerance when combined with cisplatin.It can also reduce the amount and toxicity of cis?platin.It provides a basis for finding an effective way to treat lung cancer.

carcinoma，non-small-cell lung；iron chelating agents；cisplatin；cell proliferation；apoptosis；deferasirox

R734.2

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.007

1天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所、衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點實驗室（郵編300070）；2天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院

袁婷（1989），女，碩士在讀，主要從事內(nèi)分泌代謝病研究

△E-mail：bbrui2003@hotmail.com小細胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%，總的5年平均生存率不超過15%，有癥狀者≤10%［1］。鐵與腫瘤細胞的增殖、凋亡關(guān)系密切，其可以影響人肺腺癌A549細胞的凋亡［2］，在人類非小細胞肺癌中起到關(guān)鍵作用［3］。目前已有鐵鰲合劑用于治療腫瘤的研究報道［4］。雖然目前應(yīng)用于臨床的鐵鰲合劑，去鐵胺、去鐵酮等對腫瘤細胞具有殺傷性，但是其血漿半衰期短，代謝迅速，口服吸收差，需要連續(xù)皮下或靜脈輸注長期給藥等，患者依從性差，所以仍然需要尋找治療肺癌有效、方便的藥物。以鉑類為基礎(chǔ)的一線化療方案治療老年晚期NSCLC療效較好［5］。本研究利用另一種高效口服的鐵鰲合劑地拉羅斯、地拉羅斯聯(lián)合順鉑作用肺腺癌細胞，以期提高癌細胞增殖抑制率及凋亡率，增強化療藥物的敏感性，旨在為肺癌治療及研究方面奠定基礎(chǔ)。