司來吉蘭對帕金森病模型大鼠黑質紋狀體TH及GDNF表達的影響

呂超男，毛文靜，馬原源，劉斌，張晉霞，孫靜，成曉華，李世英

司來吉蘭對帕金森病模型大鼠黑質紋狀體TH及GDNF表達的影響

呂超男，毛文靜，馬原源，劉斌△，張晉霞，孫靜，成曉華，李世英

目的觀察司來吉蘭對帕金森病（PD）模型大鼠黑質紋狀體內酪氨酸羥化酶（TH）及膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）表達的影響，探討司來吉蘭對多巴胺能神經元的保護作用及機制。方法72只健康雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組和司來吉蘭組，每組均設4 d和8 d 2個亞組，各12只。模型組和司來吉蘭組采用頸背部皮下注射魚藤酮制備PD模型，對照組皮下注射等體積葵花油。之后司來吉蘭組每日灌胃咪多吡0.5 mg/kg，模型組和對照組每日灌胃等體積生理鹽水，4 d和8 d組分別連續灌胃4 d和8 d。采用免疫組化法和Western blotting法檢測黑質紋狀體TH和GDNF表達水平。結果免疫組化法和Western blotting法檢測結果均顯示，對照組大鼠黑質紋狀體可見多量TH陽性細胞表達和少量GDNF陽性細胞表達，8 d和4 d組差異均無統計學意義。模型組TH和GDNF陽性細胞表達均明顯低于對照組（均P＜0.05），8 d和4 d組差異均無統計學意義。司來吉蘭組TH陽性細胞表達低于對照組而高于模型組，GDNF陽性細胞表達高于對照組和模型組（均P＜0.05），且8 d組均高于4 d組（均P＜0.05）。結論司來吉蘭可減輕PD模型大鼠黑質紋狀體多巴胺能神經元的損傷，其作用機制可能與增加GDNF表達有關。

帕金森病；酪氨酸單氧化酶；膠質細胞源性神經營養因子；多巴胺；單胺氧化酶抑制劑；酪氨酸羥化酶；司來吉蘭

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是好發于中、老年人的慢性神經系統變性疾?。?］，其主要病理變化是中腦黑質紋狀體通路多巴胺能神經元變性死亡，導致紋狀體內多巴胺（DA）水平不足。研究表明膠質細胞源性神經營養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）可明顯改善多巴胺細胞和神經纖維的數量，恢復DA表達水平，運動癥狀也明顯改善，提示GDNF可對黑質紋狀體起保護和修復作用，并已成為治療PD的新嘗試［2］。單胺氧化酶B （MAO-B）抑制劑能夠專一性抑制DA分解，維持腦內DA水平，延緩PD患者癥狀的發展，具有保護神經的作用［3-4］。司來吉蘭作為一種選擇性的單胺氧化酶B抑制劑，能保護黑質細胞免于各種神經毒素的侵害［5］，但其作用機制還尚不清楚。本研究采用頸背部皮下注射魚藤酮制備PD模型大鼠，觀察司來吉蘭對PD模型大鼠黑質紋狀體內酪氨酸羥化酶（tyro?sine hydroxylase，TH）及GDNF表達的影響，探討司來吉蘭對多巴胺能神經元的保護作用及其機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物清潔級健康雄性SD大鼠72只，體質量250～300 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證編號11400500000020，設施許可證編號syxk（冀）2010-0038。在河北聯合大學屏障環境動物實驗室自由進食喂養，室溫控制在（23±2）℃，自然光照，實驗前適應喂養2周。

1.1.2主要試劑及儀器鹽酸司來吉蘭（咪多吡，Eldepryl，批準文號：H20040400），片劑，規格5 mg/片，產地：Orion Cor?poration Espoo，Finland；魚藤酮（批號201212）、SP-0023免疫組化試劑盒（批號201302）、兔抗大鼠TH抗體和兔抗大鼠GDNF抗體均購自北京博奧森生物工程有限公司；DAB顯色液購自北京中杉生物有限公司；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子質量標準蛋白購自華美生物公司；高速臺式離心機購自上海安亭科學儀器廠?？ㄓ唾徸援數爻小?/p>

1.2方法

1.2.1動物分組采用隨機數字表法將72只大鼠隨機分為對照組、模型組和司來吉蘭組，3組均分別設4 d和8 d 2個亞組，每個亞組12只（其中6只用于免疫組化檢測，6只用于Western blotting檢測）。

1.2.2動物模型制備與給藥采用頸背部皮下注射魚藤酮制備PD模型大鼠［6］。魚藤酮以葵花油配制成乳液，充分震蕩混勻后避光保存。模型組和司來吉蘭組大鼠稱質量后以魚藤酮2 mg/kg體質量計算魚藤酮葵花油乳液用量。捏起大鼠頸背部皮膚，用1 mL注射器皮下注射魚藤酮葵花油乳液。對照組皮下注射等體積葵花油。行為學評分：1分，大鼠出現拒捕行為減弱、豎毛、毛色變黃變臟、弓背、主動活動減少；2分，有1分的表現，且主動活動減少明顯、動作遲緩，并有震顫，或有步態不穩；4分，有2分的表現，且步態不穩，或不能直線行走、或行步時向一側旋轉；6分，向單側斜臥，單側前肢和（或）后肢癱瘓，行走困難、進食困難；8分，單側，前肢和（或）后肢完全癱瘓，四肢拘攣，體質量大幅度減輕，不能進食；10分，瀕死狀態或死亡［7］。本實驗選取2～6分大鼠入選PD模型。之后司來吉蘭組每日灌胃咪多吡0.5 mg/kg，模型組和對照組每日灌胃等體積生理鹽水，4 d和8 d 2個亞組分別連續灌胃4 d和8 d。

1.2.3標本制備 （1）免疫組化標本制備。用10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔麻醉動物，將動物后仰臥固定，然后開胸，左心室穿刺，剪開右心耳，快速灌注生理鹽水100～200 mL（4℃）至肝臟完全變白，右心耳流出澄清液體后，繼之灌入含4%多聚甲醛0.1 mol/L的PBS（pH 7.4，4℃）200～400 mL，先快后慢灌注，至大鼠肝臟變硬，肢體僵直，即固定完成，約1～2 h。然后完整取出鼠腦后再投入4%多聚甲醛0.1 mol/L的PBS（pH 7.4，4℃）過夜固定保存。然后依據大鼠腦解剖圖譜在大鼠黑質紋狀體取材，進行常規脫水、石蠟包埋。選擇4 μm厚度連續切片，撈片后置60℃的烤箱中烘干備用。（2）Western blotting標本制備。用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）對大鼠進行深度麻醉。斷頭后于冰上開顱取腦，用冷的PBS漂洗殘余血，立即分離出新鮮黑質紋狀體，將黑質紋狀體組織置于15 mL離心管中，組織勻漿機12 000 r/min勻漿15 s，加入4℃預冷的組織裂解液，振蕩混勻，4℃作用30 min后，將細胞懸液置4℃低溫離心12 000 r/min，離心10 min后取上清液4℃保存。經蛋白定量后分裝，用4℃預冷的PBS調蛋白濃度到一致（750 mg/L），加入等體積的上樣緩沖液，在沸水中至少煮5 min，置于4℃備用。

1.2.4檢測方法 （1）免疫組化法。取各組制備好的黑質紋狀體組織切片，加入正常羊血清封閉液中，分別滴加兔抗大鼠TH一抗（1∶200）、兔抗大鼠GDNF一抗（1∶200）4℃過夜，滴加二抗和適量辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，進行DAB顯色。按試劑說明書操作要求檢測各組TH和GDNF蛋白表達。光鏡下觀察，胞漿呈棕黃色，核呈淺藍色或紫藍色為陽性細胞。高倍鏡下隨機分別觀察各組大鼠黑質紋狀體不重疊的6視野，進行TH和GDNF陽性細胞計數。（2）West?ern blotting法。取各組制備好的黑質紋狀體組織20 μg，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離后，以濕轉法電轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene flu?oride，PVDF）膜上。轉移緩沖液（甘氨酸5.8 g，Tris 2.9 g，SDS 0.37 g，800 mL重蒸餾水溶解后加入200 mL甲醇）。轉移后的PVDF膜放入封閉液中封閉，然后分別加入稀釋好的兔抗大鼠TH一抗（1∶500）、兔抗大鼠GDNF一抗（1∶500）4℃孵育過夜。PBS洗膜，加人相應稀釋好的二抗（羊抗兔，1∶2 000），37℃反應1 h，洗膜，以ECL顯色，膠片曝光顯影，使用Image J軟件進行平均灰度值測定。

1.3統計學方法采用SPSS 13.0統計軟件進行統計處理，所得數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組TH和GDNF免疫組化檢測結果對照組大鼠黑質紋狀體可見多量TH陽性細胞表達和少量GDNF陽性細胞表達，8 d和4 d組比較差異均無統計學意義。模型組TH和GDNF陽性細胞表達均明顯低于對照組（均P＜0.05），8 d和4 d組比較差異均無統計學意義。司來吉蘭組TH陽性細胞表達低于對照組而高于模型組，GDNF陽性細胞表達高于對照組和模型組（均P＜0.05），且8 d組均高于4 d組（均P＜0.05）。見表1，圖1、2。

Tab.1　The number of the positive expression of TH，GDNF in substantia nigra and striatum in each group表1　各組黑質紋狀體TH和GDNF陽性細胞數?。╪=6，個/視野，±s）

Tab.1　The number of the positive expression of TH，GDNF in substantia nigra and striatum in each group表1　各組黑質紋狀體TH和GDNF陽性細胞數　（n=6，個/視野，±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組司來吉蘭組F TH t 4 d 79.66±2.80 50.83±5.03a66.83±5.07ab74.824＊8 d 78.16±6.40 50.33±5.16a72.33±4.41ab44.525＊0.526 0.170 2.262＊組別對照組模型組司來吉蘭組F GDNF 4 d 15.83±2.31 12.67±1.63a19.50±2.59ab14.287＊t 8 d 16.67±2.16 11.67±2.16a22.50±3.01ab26.106＊0.644 0.905 2.255＊

2.2各組TH和GDNF蛋白Western blotting檢測結果對照組大鼠黑質紋狀體可見多量TH陽性細胞表達和少量GDNF陽性細胞表達，8 d和4 d組比較差異均無統計學意義。模型組TH和GDNF陽性細胞表達均明顯低于對照組（均P＜0.05），8 d和4 d組比較差異均無統計學意義。司來吉蘭組TH陽性細胞表達低于對照組而高于模型組，GDNF陽性細胞表達高于對照組和模型組（均P＜0.05），且8 d組均高于4 d組（均P＜0.05）。見表2，圖3、4。

Tab.2　The expression of TH and GDNF in substantia nigra and striatum in each group表2　各組大鼠黑質紋狀體TH和GDNF蛋白表達量?。╪=6，±s）

Tab.2　The expression of TH and GDNF in substantia nigra and striatum in each group表2　各組大鼠黑質紋狀體TH和GDNF蛋白表達量?。╪=6，±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別對照組模型組司來吉蘭組F TH 4 d 24 807.00±662.86 14 866.78±785.08a19 739.33±931.58ab231.197＊8 d 24 964.00±461.39 14 061.67±599.89a20 817.17±706.01ab508.843＊t 0.476 1.995 2.259＊組別對照組模型組司來吉蘭組F GDNF 4 d 31 615.00±590.89 20 722.50±634.65a32 625.83±963.92ab466.410＊8 d 31 742.83±1 477.59 19 910.50±834.27a34 049.33±1 225.25ab236.431＊t 0.197 1.897 2.237＊

3　討論

采用頸背部皮下注射魚藤酮的方法制備PD動物模型，能較好地模擬PD的慢性進行性病程和發病特點，已被廣泛用于PD發病機制和治療的研究［8］。本研究結果顯示，造模后大鼠出現震顫、僵直、運動減少，活動遲緩，行步時向一側旋轉等行為學改變，大鼠黑質紋狀體的TH顯著減少，表明造模成功。

TH是腦內最重要的一條DA遞質通路，即黑質-紋狀體通路的起始步驟，在DA生物合成的調節中發揮重要作用［9］。已有研究顯示，PD模型組動物TH陽性神經元較正常組動物顯著減少［10］。本研究免疫組化法和Western blotting法檢測結果均顯示，模型組TH陽性細胞表達明顯低于對照組，8 d組在數值上低于4 d組，但差異無統計學意義；司來吉蘭組TH陽性細胞表達低于對照組，高于模型組，且8 d組高于4 d組，提示司來吉蘭可以減輕PD模型大鼠黑質紋狀體多巴胺能神經元的損傷，隨著時間的延長，作用更明顯。

神經營養因子在神經元的發育、分化、生存過程中的營養作用近年受到普遍重視［11］。GDNF是黑質紋狀體通路中重要的靶源性神經營養因子，對多巴胺能神經元具有高效特異性營養活性，它通過增強細胞凋亡抑制基因的表達，并減少凋亡促進基因的表達，保護黑質多巴胺能神經元，并對其進行修復［12］。近來有研究表明GDNF可以通過激活PI3K/ Akt通路保護多巴胺能神經元［13］。既往研究顯示用不同方式給予PD模型動物GDNF可以明顯改善PD癥狀［1］。司來吉蘭是一種選擇性的單胺氧化酶B抑制劑，不僅能增加抗氧化酶的濃度、減輕細胞凋亡，還可以產生神經營養因子，如神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養因子（BDNF）、GDNF，阻止毒素的激活和自由基的形成，增強內源性和外源性DA的作用，延緩PD進展［14-15］。無論是用于早期PD患者的單藥治療，還是與其他PD治療藥物聯合使用，均顯示出較好的治療效果［16］。本研究的免疫組化法和Western blotting法檢測結果均顯示，模型組GDNF陽性細胞表達明顯低于對照組，8 d組在數值上低于4 d組，但差異無統計學意義，提示GDNF在PD的發病過程中發揮重要作用；司來吉蘭組GDNF陽性細胞表達高于對照組和模型組，且8 d組高于4 d組，提示司來吉蘭可以增加PD模型大鼠黑質紋狀體GDNF陽性細胞表達，隨著時間的延長，作用更明顯。

綜上所述，司來吉蘭可減輕PD模型大鼠黑質紋狀體多巴胺能神經元的損傷，其作用機制可能與增加GDNF表達有關。

（圖1～4見插頁）

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（2014-03-13收稿2014-10-11修回）

（本文編輯陳麗潔）

Effects of Eldepryl on TH and GDNF expressions in substantia nigra and striatum in Parkinson's disease model in rat

LYU Chaonan，MAO Wenjing，MA Yuanyuan，LIU Bin△，ZHANG Jinxia，SUN Jing，CHENG Xiaohua，LI Shiying
First Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Hebei United University，Tangshan 063000，China
△Corresponding AuthorE-mail：liubintsh@126.com

ObjectiveTo observe the effects of Eldepryl on expressions of tyrosine hydroxylase（TH）and glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF）in substantia nigra and striatum in Parkinson's disease（PD）and to explore the protective mechanism of Eldepryl on dopaminergic neuron.MethodsHealthy male Sprague-Dawley（SD）rats（n=72）were randomly divided into control group，model group and Eldepryl group（n=24 in each group）.Each group was divided random?ly into 2 subgroups as 4 day treatment group and 8 day treatment group（n=12 in each subgrop）.Pakinson's disease model was established by injecting rotenone subcutaneously back the neck，rats in the control group were injected with an equal vol?ume of sunflower oil subcutaneously at the same location.Rats in the Eldepryl group were then given Eldepryl 0.5 mg·kg-1in?tragastrically every day for 4 or 8 consecutive days and rats in model group and control group were given an equal volume of saline instead.The expression of TH and GDNF in substantia nigra and striatum were detected by immunohistochemistry and Western blotting.ResultsImmunohistochemistry and Western blotting showed that strong expression of TH positive cells with little expression of GDNF positive cells were seen in substantia nigra and striatum in rats of control group，and there was no significant difference between subgroup of 8 day treatment and 4 day treatment within control group.The expression of TH cells and GDNF were both significantly reduced in model group compared with those in control group（both P＜0.05），and there was no significant difference between subgroup of 8 day treatment and 4 day treatment within each group.The ex?pression of TH positive cells were significantly reduced in Eldepryl group compared with those in control group，and were sig?nificantly increased compared with those in model group.The expression of GDNF positive cells were significantly increasedin Eldepryl group compared with those in control group and model group（all P＜0.05）.And there were significantly more ex?pression of TH positive cells and GDNF positive cells at subgroup of 8 day treatment compared with those at subgroup of 4 day treatment within Eldepryl group with（all P＜0.05）.ConclusionThese data suggest that Eldepryl can protect the dam?age of dopaminergic neurons in substantia nigra and striatum of PD rats.And its therapeutic mechanism may be associated with increased expression of GDNF.

Parkinson's disease；tyrosine 3-monooxygenase；glial cell line-derived neurotrophic factor；dopamine；monoamine oxidase inhibitors；tyrosine hydroxylase；Eldepryl

R742.5

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.011

河北省醫學科學研究重點課題（20130064）

河北聯合大學附屬醫院神經內一科（郵編063000）

呂超男（1986），女，醫師，碩士，主要從事神經變性疾病方面研究

△E-mail：liubintsh@126.com