伊馬替尼對兔頸動脈內膜增生的作用及機制研究

路雅茹，于珍，楊萬松，崔麗，李廣平△

伊馬替尼對兔頸動脈內膜增生的作用及機制研究

路雅茹1，于珍2，楊萬松3，崔麗3，李廣平3△

目的探討伊馬替尼對動脈球囊損傷后新生內膜的作用及機制。方法長耳白兔30只，按隨機數字表法分為A、B、C組，分別于右側頸動脈球囊拉傷后給予0、25、50 mg/kg伊馬替尼灌胃1次/d，連續用藥14 d處死。取雙側頸動脈行HE及免疫組化染色A組左側頸動脈為對照組；逆轉錄PCR檢測血小板衍生生長因子（PDGF）-B及受體PDGFR-β mRNA水平。ELISA法檢測PDGF-BB血漿水平。結果 （1）術后新生內膜厚度、面積、內/中膜厚度及面積比值較對照組均增加（P＜0.05）。（2）術側組織PDGF-B mRNA水平A組高于B組及C組（2.961±0.686、1.957±0.545、1.879±0.636，F=8.353，P＜0.01）；PDGFR-β mRNA水平僅C組高于A組（1.236±0.356 vs 0.708±0.372，P＜0.01）。（3）各組術后血漿PDGF-BB水平均高于術前（P＜0.01），且A組＞B組＞C組（ng/L：23.464±3.542、19.504± 2.454、16.588±1.207，F=17.322，P＜0.05）。（4）血漿PDGF-BB水平與PDGF-B mRNA水平正相關（r=0.806，P＜0.01）。結論伊馬替尼通過抑制PDGF-B mRNA表達而抑制動脈內膜損傷后新生內膜過度增生。

頸動脈損傷；血管內膜；甲磺酸鹽類；血小板源性生長因子；受體，血小板源生長因子β；伊馬替尼

支架內再狹窄是影響經皮冠狀動脈介入治療（PCI）遠期療效的主要問題，即使應用藥物涂層支架仍存在5%左右的再狹窄率［1］。有大量研究發現血管內皮受損后中膜平滑肌細胞向內膜遷移進入損傷部位并過度增生是再狹窄的主要病理機制［2-3］。血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）-B的生物活性形式PDGF-BB通過激活其受體PDGFR（platelet-derived growth factor receptor）-β的酪氨酸激酶，參與平滑肌細胞的增殖與遷移［4］。PDGFR-β抑制劑甲磺酸伊馬替尼（Imatinib mesi?late）有可能通過抑制PDGF-BB/PDGFR-β途徑起到抑制PCI術后再狹窄的作用［5］。本研究擬通過兔頸動脈球囊損傷模型，探討伊馬替尼對新生內膜的作用及相關機制，為防治PCI術后再狹窄尋找新的干預靶點。

1　材料與方法

1.1動物模型建立大耳白兔（軍事醫學科學院實驗動物中心，普通級）30只，3～4月齡，體質量（2.0±0.2）kg，顆粒飼料常規喂養1周適應環境。按隨機數字表法分為單純球囊損傷組（A組）、小劑量伊馬替尼組（B組）和大劑量伊馬替尼組（C組），每組10只，雌雄各半。耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉；分離右側頸動脈；鉗夾頸內動脈，頸總動脈近心端線拉阻斷血流，穿刺頸外動脈插入冠脈球囊導管；術前行頸動脈超聲測量頸動脈直徑，根據血管直徑選擇1.5 mm×15 mm至2.5 mm×15 mm球囊，0.6～1.2 MPa膨脹球囊至可以推拉球囊但有一定阻力即可，自頸內外動脈分叉處至頸總動脈起始部反復推拉球囊5次以造成頸總動脈內膜損傷。造模成功A組9只、B組8只、C組10只。術后A組生理鹽水5 mL灌胃1次/d，B組伊馬替尼（諾華制藥有限公司）25 μg/kg灌胃1次/d，C組伊馬替尼50 μg/kg灌胃1次/d，連續給藥14 d后處死。

1.2HE染色及免疫組化染色取術側及對側頸總動脈各1.0 cm浸入10%中性福爾馬林液中固定，常規制作病理切片，行HE染色。SEM-IPS圖像分析系統（日本SONY公司）測量動脈內膜厚度（intima thickness，IT）、中膜厚度（media thickeness，MT），計算內/中膜厚度比（IT/MT）。測量管腔面積、內彈力板圍繞面積和外彈力板圍繞面積；計算內膜面積（intima area，IA）=內彈力板圍繞面積-管腔面積，中膜面積（media area，MA）=外彈力板圍繞面積-內彈力板圍繞面積，計算內/中膜面積比（IA/MA）。以A組左側頸總動脈為對照組。免疫組化染色：脫蠟切片與3%過氧化氫37℃孵育10 min。熱修復抗原。滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫2 min。滴加適當比例稀釋的一抗（小鼠抗兔α-SMA單克隆抗體，武漢博士德），37℃過夜。PBS液洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃20 min，PBS洗5 min×4次。DAB顯色（ZLI-9017，中杉金橋）。蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。

1.3PDGF-B、PDGFR-β mRNA表達水平測定 （1）總RNA提取：利用Trizol（Invirtrogen公司）提取頸總動脈組織勻漿中總RNA；紫外分光光度計測定光密度（OD）260/OD280，當值為1.8～2.0時RNA純度較高，計算RNA濃度（g/L）=OD260×稀釋倍數×40/1 000。（2）逆轉錄：利用 SuperScript?Ⅲ Reverse Transcriptase試劑盒（Invirtrogen公司）完成。總RNA 5 μg加入50 μmol/L oligio（dt）1 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、DEPC水3 μL，組成10 μL Mix1，65℃水浴5 min；然后加入10×RT buffer 2 μL、25 mmol/L Mg2+4 μL、0.1 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）2 μL、RNaseout（40 U/μL）1 μL、SuperScripⅢRT（200 U/μL）1 μL，組成20 μL Mix2；在PCR儀中，按照50℃50 min、85℃5 min順序進行逆轉錄，Mix2中加入1 μL核糖核酸酶H（Rnase H），37℃20 min，得到cDNA。（3）探針法實時定量PCR（Taqman-RQ-PCR）：在GenBank中查到兔組織PDGF-B、PDGFR-β及GAPDH的mRNA序列，應用Primer Premier 5.0設計引物，并由上海生工生物技術有限公司合成，見表1。PCR反應體系50 μL：cDNA模板5 μL、上游引物（10 μmol/L）3 μL、下游引物（10 μmol/L）3 μL、Taqman探針（10 μmol/L）1.25 μL、Universal PCR Mix 25 μL（美國ABI公司）、滅菌蒸餾水12.75 μL。在實時定量PCR儀（美國ABI公司7500）中進行PCR擴增，95℃10 s、60℃30 s、70℃45 s，40個循環。

Tab.1　Primer sequences of PDGF-B，PDGFR-β and GAPDH表1　PDGF-B、PDGFR-β及GAPDH引物序列

1.4血漿PDGF-BB水平測定術前及處死前（術后）經左側頸靜脈取血2 mL，EDTA抗凝，3 000 r/min、15 min，離心分離血漿。ELISA法（武漢基因美）測定血漿PDGF-BB水平。

1.5統計學方法以SPSS 11.5處理全部數據。計量資料以均數±標準差（±s）表示。術前術后均數比較采用配對t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析（ANOVA），樣本均數間的多重比較采用LSD-t檢驗；血漿PDGF-BB水平與PDGF-B、PDGFR-β mRNA表達水平的相關性采用Pearson相關。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1HE染色及免疫組化染色結果對照組動脈內膜光滑，無增厚，內彈力板完整。3組右側頸動脈球囊拉傷術后內膜顯著增生。A組內膜增生最明顯，厚度超過中膜，細胞排列紊亂；C組新生內膜厚度顯著低于A組、B組，僅見極輕度內膜增生。3組外膜均增厚，呈A組＞B組＞C組＞對照組的趨勢，A組外膜增生最明顯、有大量纖維組織增生，C組外膜增厚最輕，見圖1。免疫組化染色所示α-SMA表達定位于細胞漿，陽性為棕黃色。3組新生血管內膜及各組血管中膜均呈棕黃色α-SMA陽性表現，見圖2。

2.2血管內、中膜厚度及面積比較與對照組比較，3組右側頸動脈球囊拉傷術后IT、MT、IT/MT、IA、MA、IA/MA均顯著增加（P＜0.05）。IT、IT/MT、IA、IA/MA之間A組＞B組＞C組（P＜0.05），A組的MA大于B組及C組（P＜0.05），B組與C組之間差異無統計學意義；MT在A、B、C組之間差異無統計學意義，見表2。

Tab.2　Comparison of intima and media thickness as well as intima and media area表2　各組內膜、中膜厚度及面積比的比較　（±s）

Tab.2　Comparison of intima and media thickness as well as intima and media area表2　各組內膜、中膜厚度及面積比的比較　（±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與A組比較，c與B組比較，P＜0.05

組別對照組A組B組C組F n9 9 8 1 0 IT（μm）2.46±0.35 120.33±19.46a84.33±10.98ab14.79±4.40abc227.122＊＊MT（μm）50.29±3.29 78.52±12.02a77.18±6.59a75.17±11.39a18.960＊＊IT/MT（%）4.9±0.6 153.8±17.4a109.7±14.8ab19.8±5.9abc346.898＊＊組別對照組A組B組C組F n9 9 8 1 0 IA（μm2）5 635±894 386 341±104 251a187 573±69 749ab64 128±11 244abc67.531＊＊MA（μm2）154 812±8 298 310 860±59 696a279 345±68 344ab267 390±52 193ab15.396＊＊IA/MA（%）3.640±0.499 123.240±19.761a68.510±24.081ab24.420±4.016abc111.191＊＊

2.3PDGF-B、PDGFR-β mRNA表達水平術側PDGF-B mRNA表達水平比較，A組高于自身對側（P＜0.01），B組、C組與自身對側比較差異無統計學意義（P＞0.05）；3組之間比較，A組高于B組及C組（P＜0.05），B、C組之間比較差異無統計學意義。術側PDGFR-β mRNA表達水平C組高于A組（P＜0.05），A組、B組分別與自身對側比較差異無統計學意義，C組顯著高于自身對側（P＜0.01），見表3。

2.4血漿PDGF-BB水平血漿PDGF-BB水平每組術后均顯著高于術前（P＜0.01）；術前A、B、C組間差異無統計學意義，術后3組間PDGF-BB水平A組＞B組＞C組（P＜0.01），見表4。

2.5術后血漿PDGF-BB水平與PDGF-B、PDGFR-β mRNA表達水平的相關性術后A、B、C組血漿PDGF-BB水平與PDGF-B mRNA表達水平均呈正相關（r分別為0.701、0.845和0.786，均P＜0.05）。全部實驗兔（n=27）血漿PDGF-BB水平與PDGF-B mRNA表達水平呈正相關（r=0.806，P＜0.01）。術后血漿PDGF-BB水平與A、B、C組及全部實驗動物間PDGFR-β mRNA表達水平均無相關性（r分別為0.028、-0.115、0.276和-0.379，均P＞0.05）。

Tab.3　Comparisons of mRNA levels of PDGF-B and PDGFR-β表3　3組術后PDGF-B、PDGFR-β mRNA表達水平比較　（±s）

Tab.3　Comparisons of mRNA levels of PDGF-B and PDGFR-β表3　3組術后PDGF-B、PDGFR-β mRNA表達水平比較　（±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a與A組比較，P＜0.05

組別A組B組C組F n　9 8 1 0 PDGF-B術側2.961±0.686 1.957±0.545a1.879±0.636a8.353＊＊對側1.502±0.342 1.429±0.349 1.468±0.257 0.181 t 5.567＊＊2.272 1.823組別A組B組C組F n　9 8 1 0 PDGFR-β術側0.708±0.372 0.948±0.464 1.236±0.356a4.248＊對側0.451±0.411 0.660±0.471 0.538±0.476 0.451 t 1.172 1.539 4.015＊＊

Tab.4　Comparisons of PDGF-BB plasma level表4　3組血漿PDGF-BB水平比較　（ng/L，±s）

Tab.4　Comparisons of PDGF-BB plasma level表4　3組血漿PDGF-BB水平比較　（ng/L，±s）

＊＊P＜0.01，a與A組比較，b與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組F n9 8 1 0術前15.066±1.700 14.623±1.276 14.415±0.980 0.574術后23.464±3.542 19.504±2.454a16.588±1.207ab17.322＊＊t 7.549＊＊6.608＊＊9.530＊＊

3　討論

PDGF-B是24 ku的陽離子糖蛋白，由成纖維細胞、平滑肌細胞等細胞合成與釋放，PDGF-BB是其生物活性形式，具有化學趨化、促細胞分裂和促血管收縮作用［6-7］。PDGF-B主要與受體PDGFR-β結合，使PDGFR-β發生二聚化和自身酪氨酸殘基磷酸化，激活下游信號通路的級聯反應，促進平滑肌細胞增生、遷移，參與重要生理過程［8-9］。Nakagawa等［10］對支架術后患者尸檢發現，在支架處新生內膜高度分化的平滑肌細胞中可檢測出PDGF-B及PDGFR-β，提示PDGF-B及PDGFR-β與PCI術后血管內膜修復密切相關。

伊馬替尼可抑制PDGFR，從而抑制PDGF介導的平滑肌細胞遷移、增生，起到抑制心肌纖維化、抑制肺動脈高壓的作用［11-12］。伊馬替尼是否可以抑制支架內再狹窄，尚不明確。Makiyama等［5］發現，球囊損傷大鼠頸動脈后平滑肌細胞過度增生，7 d達高峰，14 d平滑肌細胞增殖停止，達到有效藥物干預時長。因此，本研究也給予動物模型用藥14 d。本研究HE染色顯示單純球囊損傷動脈內膜2周后，損傷的血管內膜均顯著增生，細胞排列紊亂，而未損傷的對照組血管內膜光滑無增生，內彈力板完整。免疫組化染色顯示新生內膜呈抗α-SMA陽性反應，提示新生血管內膜由平滑肌細胞過度增生而成。給予不同劑量伊馬替尼后，B組及C組平滑肌細胞增殖顯著受到抑制，IT、IA、IT/MT、IA/MA均下降，且與伊馬替尼呈劑量依賴性關系。

每組術側頸動脈PDGF-B mRNA表達水平均高于自身對側頸動脈，但僅A組差異有統計學意義，3組術側PDGF-B mRNA表達水平呈伊馬替尼劑量依賴性下降趨勢，提示伊馬替尼有效抑制損傷血管組織PDGF-B mRNA表達。術后C組術側血管組織PDG?FR-β mRNA表達高于自身對側頸動脈，術側3組間PDGFR-β mRNA表達水平隨伊馬替尼劑量增加呈升高趨勢，但僅C組與A組間差異有統計學意義。

伊馬替尼可以抑制組織局部PDGF-B蛋白水平、降低血漿PDGF-BB水平［12-13］。本研究表明單純球囊損傷頸動脈后血漿PDGF-BB水平顯著升高，給予不同劑量的伊馬替尼，B組及C組血漿PDGFBB水平顯著低于A組，提示伊馬替尼可以抑制動脈內膜損傷后血漿PDGF-BB水平升高。但無論B組還是C組術后PDGF-BB水平仍高于術前水平，如果進一步增加劑量是否可以完全抑制PDGF-BB水平升高及動脈內膜的過度增生，尚需進一步實驗研究證實。血漿PDGF-BB水平與損傷段血管組織PDGF-B mRNA表達水平正相關，提示血漿PDGFBB水平可以間接反映損傷血管組織PDGF-B mRNA表達的程度。這可能是伊馬替尼抑制PDGF-B mRNA表達，進而影響血漿蛋白水平的結果。

通過研究筆者發現球囊損傷后新生血管內膜過度增生，伊馬替尼通過抑制PDGF-B mRNA表達影響PDGF-BB/PDGFR-β通路，從而抑制新生內膜的過度增生。若將PDGF-BB/PDGFR-β信號通路作為干預靶點，以伊馬替尼作為支架藥物涂層，是否可以降低PCI術后再狹窄的發生，尚需日后基礎及臨床研究進一步闡明。

（圖1、2見插頁）

［1］Dehmer GJ，Smith KJ.Drug-eluting coronary artery stents［J］.Am Fam Physician，2009，80（11）:1245-1251.

［2］Guildford AL，Stewart HJ，Morris C，et al.Substrate-induced pheno?typic switches of human smooth muscle cells:an in vitro study of instent restenosis activation pathways［J］.J R Soc Interface，2011，8 （58）:641-649.doi:10.1098/rsif.2010.0532.

［3］Wang L，Zhang J，Bai X，et al.ADAMTS-7 mediates vascular smooth musle cell migration and neointima formation in balloon-in?jured rat arteries［J］.Circ Res，2009，104（5）:688-698.doi:10.1161/ CIRCRESAHA.108.188425.

［4］Mousseau Y，Mollard S，Richard L，et al.Fingolimod inhib?its PDGF-B-induced migration of vascular smooth muscle cell by down-regulating the S1PR1/S1PR3 pathway［J］.Biochimie，2012，94 （12）:2523-2531.doi:10.1016/j.biochi.2012.07.002.

［5］Makiyama Y，Toba K，Kato K，et al.Imatinib mesilate inhibits neo?intimal hyperplasia via growth inhibition of vascular smooth muscle cells in a rat model of balloon injury［J］.Tohoku J Exp Med，2008，215（4）:299-306.doi:10.1620/tjem.215.299.

［6］Martins M，Warren S，Kimberley C，et al.Activity of PLCε contrib?utes to chemotaxis of fibroblasts towards PDGF［J］.J Cell Sci，2012，125（Pt23）:5758-5769.doi:10.1242/jcs.110007.

［7］Zhang ZW，Yanamoto H，Nagata I，et al.Platelet-derived growth factorinduced severe and chronic vasoconstriction of cerebral arteries: proposed growth factor explanation of cerebral vasospasm［J］.Neuro?surgery，2010，66（4）:728-735.

［8］Friedlaender GE，Lin S，Solchaga LA，et al.The role of recombinant human platelet-derived growth factor-BB（rhPDGF-BB）in ortho?paedic bone repair and regeneration［J］.Curr Pharm Des，2013，19 （19）:3384-3390.doi:10.2174/1381612811319190005.

［9］Hosaka K，Yang Y，Seki T，et al.Tumour PDGF-BB expression lev?els determine dual effects of anti-PDGF drugs on vascular remodel?ling and metastasis［J］.Nat Commun，2013，4:2129.doi:10.1038/ ncomms3129.

［10］Nakagawa M，Naruko T，Ikura Y，et al.A decline in platelet activa?tion and inflammatory cell infiltration is associated with the pheno?typic redifferentiation of neointimal smooth muscle cells after baremetal stent implantation in acute coronary syndrome［J］.J Athero?scler Thromb，2010，17（7）:675-687.doi:10.5551/jat.3426.

［11］MaLK，LiQ，HeLF，etal.Imatinibattenuatesmyocardialfibrosisinas?sociation with inhibition of the PDGFRα activity［J］.Arq Bras Cardiol，2012，99（6）:1082-1091.doi:10.1590/S0066-782X2012005000109.

［12］Xing AP，Hu XY，Shi YW，et al.Implication of PDGF signaling in cig?arette smoke-induced pulmonary arterial hypertension in rat［J］.Inhal Toxicol，2012，24（8）:468-475.doi:10.3109/08958378.2012.688885.

［13］Hatano M，Yao A，Shiga T，et al.Imatinib mesylate has the potential to exert its efficacy by down-regulating the plasma concentration of platelet-derived growth factor in patients with pulmonary arterial hypertension［J］.Int Heart J，2010，51（4）:272-276.doi:10.1536/ ihj.51.272.

（2014-04-15收稿2014-10-06修回）

（本文編輯魏杰）

Effect and mechanism of Imatinib mesilate on intimal hyperplasia of rabbit carotid artery after ballon injury

LU Yaru1，YU Zhen2，YANG Wansong3，CUI Li3，LI Guangping3△
1 Department of Cardiology，Tianjin Chest Hospital，Tianjin 300222，China；2 Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College；3 Tianjin Key Laboratory of Ionic-Molecular Function of Cardiovascular disease，Department of Cardiology，Tianjin Institute of Cardiology，Second Hospital of Tianjin Medical University
△Corresponding Author E-mail:tjcardiol@126.com

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of Imatinib mesilate（Imatinib）on intimal hyperplasia of rabbit carotid arteries after balloon injury.MethodsThirty adult Newzealand rabbits were randomly divided into three groups:group A，B and C.Their right carotid arteries were injuried then administered with 0，25 or 50 mg/kg of Imatinib dai?ly for 14 consecutive days when the rabbits were sacrificed.The carotid arteries were harvested and sectioned for HE-stain?ing and immunohistochemisty staining.Real-Time PCR was used to examine transcription levels of PDGF-B and PDGFR-β mRNA.The plasma level of PDGF-BB was assayed by ELISA.ResultsArterial intimal hyperplasia and stenosis following balloon injury were seen in three groups.Thickness and area of neointima，ratio of thickness of intima to media，ratio of area of intima to media and mRNA level of PDGF-β are all higher in group A than those in group B than those in group C（P＜0.01）.By contrast，the mRNA transcription level of PDGFR-β increased significantly in group C than that in group A （1.236±0.356 vs 0.708±0.372；t=2.91；P＜0.01）.Plasma level of PDGF-BB increased in all three groups after balloon injury than that in the baseline（P＜0.01）.The transcription level of PDGF-BB is higher in group A than that in group B and in group C（ng/L:23.464±3.542，19.504±2.454，16.588±1.207，F=17.322，P＜0.05）.There was no difference between group B and C.There was positive correlation between mRNA transcription level of PDGF-B and plasma level of PDGF-BB（r= 0.806，P＜0.01）.ConclusionVascular injury can cause intimal hyperplasia and increased PDGF-B mRNA transcription. Imatinib mesilate could inhibit the intimal hyperplasia through down regulating PDGF-B mRNA transcription.

carotid artery injuries；tunica intima；mesylates；platelet-derived growth factor；receptor，platelet-derived growth factor beta；Imatinib mesilate

R541.4

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.012

天津市衛生局科技基金資助項目（2013KZ079）

1天津市胸科醫院心內科（郵編300222）；2中國醫學科學院血液病醫院；3天津市心血管病離子與分子機能重點實驗室，天津醫科大學第二醫院心臟科，天津心臟病學研究所

路雅茹（1972），女，副主任醫師，博士，主要從事冠心病發病及支架再狹窄的機制研究

△E-mail：tjcardiol@126.com