FOXQ1和E-cadherin在食管鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

于海峰，張遜，徐美林，王菁，盧喜科

FOXQ1和E-cadherin在食管鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

于海峰1，張遜2△，徐美林3，王菁3，盧喜科2

目的探討叉頭框蛋白Q1（FOXQ1）和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）在食管鱗狀細胞癌（ESCC）中的表達及臨床意義。方法采用免疫組織化學法檢測42例ESCC組織（ESCC組）及其癌旁正常食管鱗狀上皮組織（正常組）中FOXQ1和E-cadherin的表達情況，分析其表達與患者臨床病理特征及預后的關系。結果ESCC組FOXQ1的陽性表達率高于正常組（64.29%vs 28.57%，χ2=5.384，P＜0.05），E-cadherin的陽性表達率低于正常組（52.38%vs 90.48%，χ2=7.691，P＜0.05）。FOXQ1的表達強度在不同TNM分期及不同淋巴結轉移情況間的差異有統計學意義，E-cad?herin的表達強度在不同浸潤深度、分化程度、TNM分期和淋巴結轉移情況間的差異有統計學意義。ESCC組織中FOXQ1和E-cadherin的表達呈負相關（r=-0.412，P＜0.05）。FOXQ1高表達者的5年生存率低于低表達者（18.52%vs 66.67%，χ2=9.737，P＜0.05），E-cadherin高表達者的5年生存率高于低表達者（59.09%vs 10.00%，χ2= 10.996，P＜0.05）。COX比例風險回歸模型分析結果顯示，FOXQ1高表達、E-cadherin低表達、有淋巴結轉移是影響ESCC患者預后的獨立危險因素。結論FOXQ1和E-cadherin在ESCC組織中的表達呈現較好的相關性，聯合檢測兩者的表達對于ESCC患者的預后判斷及指導治療具有一定的臨床價值。

食管腫瘤；癌，鱗狀細胞；鈣黏著糖蛋白類；預后；免疫組織化學；叉頭框蛋白Q1；E-鈣黏蛋白

食管癌是我國最為高發的惡性腫瘤之一，食管鱗狀細胞癌（ESCC）為食管癌的主要病理類型，其發病率和死亡率均較高［1］。食管癌的發病機制目前仍不明確，且其預后較差，影響其預后的相關基因是近年來的研究熱點。叉頭框蛋白Q1（forkhead box Q1，FOXQ1）是一個具有高度保守的叉頭框（FOX）結構的轉錄因子，在腫瘤的侵襲和遠處轉移過程中起重要作用［2］。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是廣泛分布在上皮組織中的跨膜糖蛋白，具有促進上皮細胞間相互黏附和保持組織結構完整性的作用［3］。腫瘤組織中FOXQ1和E-cadherin的表達及其相關機制已有報道，但綜合研究二者在食管癌的發生發展及轉移中作用的報道較少，本研究采用免疫組織化學方法檢測ESCC組織和正常食管鱗狀上皮組織中FOXQ1和E-cadherin的表達情況，分析FOXQ1和E-cadherin與ESCC患者臨床病理特征及預后之間的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2007年1月—2009年6月天津市胸科醫院胸外科收治的ESCC患者42例，其中男36例，女6例，年齡42～77歲，中位年齡62歲。按照國際抗癌聯盟（UICC）2009年修訂的第7版食管癌TNM分期標準分為：Ⅰ期4例、Ⅱ期21例、Ⅲ期17例。其中高分化7例、中分化24例，低分化11例。有淋巴結轉移18例，無淋巴結轉移24例。病變位于上段6例，中段26例，下段10例。取其手術切除的ESCC標本42例（ESCC組），均經本院病理科醫師復閱HE切片證實為ESCC，術前未經放化療；另取其癌旁正常食管鱗狀上皮組織42例（正常組）。所有標本的使用均經天津市胸科醫院倫理委員會批準，并取得患者或家屬的知情同意。并通過電話或門診等方式對患者進行隨訪，隨訪時間為手術之日起至死亡或末次隨訪時間，截至2014年6月1日。

1.2材料和試劑兔抗人FOXQ1單克隆抗體購自Abcam公司，鼠抗人E-cadherin單克隆抗體購自上海長島生物技術開發有限公司，快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物、粉劑型抗原修復液（檸檬酸法）、PBS磷酸鹽緩沖液及二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3免疫組化檢測方法標本經10%福爾馬林固定，石蠟包埋后連續切片，厚度4 μm，采用常規免疫組織化學SP法檢測，FOXQ1一抗稀釋濃度為1∶100，E-cadherin一抗稀釋濃度為1∶50，實驗步驟嚴格按照各試劑說明書進行，抗原修復采用檸檬酸緩沖液高溫高壓熱修復。陽性對照采用已知的陽性切片，采用PBS代替一抗做陰性對照。

1.4陽性結果判斷淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。根據染色細胞百分率和染色程度進行評定和分析：每例任意觀察10個高倍視野（×400），每個視野計數100個細胞，陽性細胞率=陽性細胞數/觀察細胞數×100%。FOXQ1表達參考Liang等［4］的判定標準：≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強度：黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將陽性細胞率得分和染色強度得分相乘即為最后得分：0～3分定義為低表達，4～12分定義為高表達。E-cadherin表達的判定標準：陽性細胞數＜10%為低表達，≥10%為高表達［5］。

1.5統計學方法采用SPSS 17.0軟件進行處理，計數資料比較采用χ2檢驗，FOXQ1和E-cadherin的相關性用Spear?man等級相關進行檢驗，對生存數據采用Kaplan-Meier分析并繪制生存曲線，應用Log-rank檢驗差異性，預后因素分析采用COX回歸，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.12組 FOXQ1和 E-cadherin的陽性表達情況FOXQ1和E-cadherin在正常組及ESCC組中均有表達。FOXQ1的陽性表達主要在細胞質，部分細胞核亦有表達，E-cadherin的陽性表達主要位于細胞膜，部分位于細胞質，見圖1～4。FOXQ1在ES?CC組中的陽性表達為高表達，在正常組中的陽性表達為低表達，ESCC組FOXQ1的陽性表達率高于正常組（P＜0.05）。E-cadherin在ESCC組和正常組中的陽性表達均為高表達，但ESCC組E-cadherin的陽性表達率低于正常組（P＜0.05），見表1。

Tab.1　Comparison of positive expressions of FOXQ1 and E-cadherin between two groups表1　2組FOXQ1和E-cadherin的陽性表達情況　例（%）

2.2FOXQ1和E-cadherin的表達與ESCC患者臨床病理特征的關系不同TNM分期及不同淋巴結轉移情況間FOXQ1的表達強度差異有統計學意義（P＜0.05），不同性別、年齡、腫瘤部位、浸潤深度和分化程度間FOXQ1的表達強度差異均無統計學意義；不同浸潤深度、分化程度、TNM分期和淋巴結轉移情況間E-cadherin的表達強度差異有統計學意義（P＜0.05），不同性別、年齡和腫瘤部位間E-cad?herin的表達強度差異均無統計學意義，見表2。

2.3FOXQ1和E-cadherin在ESCC組中表達的相關性分析ESCC組中FOXQ1和E-cadherin的表達呈負相關（r=-0.412，P＜0.05），見表3。

Tab.2　Comparison of expression levels of FOXQ1 and E-cadherin with different clinicopathological characteristics in ESCC groups表2　FOXQ1和E-cadherin的表達與ESCC患者臨床病理特征的關系　例（%）

Tab.3　Correlation between the expression of FOXQ1 and E-cadherin in ESCC表3　ESCC組織中FOXQ1和E-cadherin的相關性?。ɡ?/p>

2.4FOXQ1和E-cadherin的表達與ESCC患者預后的關系42例ESCC患者隨訪時間為1～65個月，中位隨訪時間46個月。FOXQ1高表達者的5年生存率（18.52%）低于低表達者（66.67%），差異有統計學意義（χ2=9.737，P＜0.05）。E-cadherin高表達者的5年生存率（59.09%）高于低表達者（10.00%），差異有統計學意義（χ2=10.996，P＜0.05），見圖5、6。

Fig.5　Kaplan-Meier survival curves for ESCC patients with regard to FOXQ1 expression圖5　FOXQ1的表達與ESCC患者生存時間的關系

Fig.6　Kaplan-Meier survival curves for ESCC patients with regard to E-cadherin expression圖6　E-cadherin的表達與ESCC患者生存時間的關系

2.5多因素COX回歸模型分析以是否有淋巴結轉移（0=否，1=是）、分化程度（0=低分化，1=中分化，2=高分化）、浸潤深度（1=T1～T2，2=T3～T4）、性別（1=男，2=女）、腫瘤部位（0=上段，1=中段，2=下段）、年齡（1=60歲及以下，2=60歲以上）、FOXQ1高表達（0=否，1=是）、E-cadherin低表達（0=否，1=是）為自變量，以生存時間為因變量，應用COX比例風險回歸模型進行分析。結果顯示，FOXQ1高表達、E-cadherin低表達、有淋巴結轉移是影響ESCC患者預后的獨立危險因素，見表4。

Tab.4　Analysis of various prognostic factors in patients with ESCC表4　COX比例風險回歸模型分析結果

3　討論

FOX家族成員眾多，在不同種屬中已證實的FOX家族成員有100多個，分屬19個亞家族，分別被命名為FOXA～S［6］。FOX家族蛋白功能涉及細胞周期調控、生物老化、免疫調節等多種生物學過程，其突變和表達異常與腫瘤發生、發展和轉移有關。FOXQ1基因屬于FOXQ亞族成員之一，在乳腺癌、胃癌、結直腸癌、非小細胞肺癌等腫瘤的發生、發展中的作用已有報道，但在食管癌發生、發展中的作用研究較少。Zhang等［2］研究發現在乳腺癌中FOXQ1基因與E-cadherin蛋白的核心啟動子區的E-box結合，抑制E-cadherin蛋白的表達，從而引起乳腺癌的發生、發展及轉移。Liang等［4］研究發現FOXQ1基因在胃癌中高表達，且與腫瘤體積、分化程度、淋巴結轉移情況及TNM分期存在顯著相關性，表明FOXQ1基因高表達與胃癌的進展和預后密切相關。本研究結果顯示，FOXQ1在正常食管鱗狀上皮組織中呈低表達，而在大部分ESCC組織中表達顯著上調，其表達強度在不同腫瘤TNM分期及淋巴結轉移情況之間的差異有統計學意義，且FOXQ1高表達是影響ESCC患者預后的獨立危險因素之一，與上述研究結果基本一致。

E-cadherin是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，介導上皮細胞之間的黏附，形成中間連接，維持組織結構和完整性。E-cadherin高表達可抑制腫瘤轉移，E-cadherin表達下降或缺失，細胞黏附力下降，造成細胞容易游離而向外周浸潤性生長，一旦獲得轉移的必要條件，就可脫離原發灶而發生侵襲和轉移［3］。近年來在非小細胞肺癌、食管癌、胃癌等腫瘤的研究中證實，E-cadherin表達降低與腫瘤的分化、侵襲和轉移有顯著相關性［7］。有研究發現食管癌中的E-cad?herin陽性表達率顯著低于正常食管組織，且淋巴結轉移組E-cadherin表達明顯低于無淋巴結轉移組，提示E-cadherin參與了食管癌細胞浸潤及轉移的過程［8］。本實驗結果與上述研究結果基本一致，E-cadherin在正常食管鱗狀上皮組織中呈高表達，而在大部分ESCC組織中表達顯著下調，其表達強度在不同腫瘤分化程度、浸潤深度、TNM分期及淋巴結轉移情況間的差異有統計學意義，且E-cadherin低表達是影響ESCC患者預后的獨立危險因素之一，提示其在腫瘤發生、發展和轉移過程中起著重要作用，并可影響患者預后。

FOXQ1和E-cadherin促進腫瘤細胞侵襲與轉移可能的機制如下：（1）FOXQ1基因的表達上調能促進上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT），EMT中最具代表性的變化就是E-cad?herin減少，而FOXQ1基因促進腫瘤侵襲的分子機制正是通過其能特異性地結合到E-cadherin核心啟動子區的E-box從而抑制其表達［2］。（2）E-cad?herin減少造成細胞間附著能力的下降，同時亦造成E-鈣黏蛋白復合物（E-cadherin complex）的降解，使β-鏈蛋白（β-catenin）進入細胞核的概率上升，導致β-catenin在細胞質內聚集，進而激活β-catenin所介導的WNT信號通路，最終導致腫瘤的發生發展與轉移［9-10］。Feng等［5］研究發現在肺癌中FOXQ1基因表達上調，E-cadherin表達下調，推測FOXQ1基因通過調控E-cadherin，使其表達下調，引起肺上皮細胞發生EMT，導致肺癌的發生和發展。Christensen等［11］研究發現原發腫瘤中FOXQ1基因表達與WNT信號通路的激活密切相關，考慮FOXQ1可作為WNT信號通路的激活的一個標記。本研究結果表明，ESCC組織中FOXQ1與E-cadherin的表達呈負相關，考慮可能是由于FOXQ1表達的增加，通過與E-cadherin核心啟動子區的E-box結合抑制E-cad?herin的表達，使細胞黏附力下降，造成細胞容易分散而向外周浸潤性生長，最終導致ESCC的發生發展乃至于轉移，但具體機制還有待進一步研究。聯合檢測二者的表達可作為判斷食管鱗癌患者其預后的參考指標之一，也可能為食管癌治療提供新的治療靶點。

（圖1～4見插頁）

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（2014-08-18收稿2014-10-16修回）

（本文編輯陳麗潔）

Expression levels and clinical significance of FOXQ1 and E-cadherin in esophageal squamous cell carcinoma

YU Haifeng1，ZHANG Xun2△，XU Meilin3，WANG Jing3，LU Xike2
1 Graduate School of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Thoracic Surgery，Tianjin Chest Hospital；3 Department of Pathology，Tianjin Chest Hospital
△Corresponding AuthorE-mail:zhangxun69@163.com

ObjectiveTo investigate the expression levels and clinical significance of（forkhead box Q1）FOXQ1 and E-cadherin in esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）.MethodsExpression levels of FOXQ1 and E-cadherin were in ESCC tissues（ESCC group，n=42）and adjacent normal esophageal tissues（control group，n=42）were detected using im?munohistochemistry.Correlations of FOXQ1 and E-cadherin expressions with clinical pathological parameters and progno?sis were analyzed between two groups.ResultsThe expression level of FOXQ1 was significantly higher in ESCC group than that in control group（64.29%vs 28.57%，χ2=5.384，P＜0.05）.The expression level of E-cadherin was significantly lower in ESCC group than that incontrol group（52.38%vs 90.48%，χ2=7.691，P＜0.05）.There were significant differences in FOXQ1 expressions between different TNM stages and whether lymph node metastasis is involved within ESCC group. There were significant differences in expression of E-cadherin between different tumor differentiation，depth of invasion，TNM stage and whether lymph node metastasis is involved within ESCC group.The expression of FOXQ1 was negatively cor?related with E-cadherin in ESCC（r=-0.412，P＜0.05）.The 5-year survival rates were significantly lower with high expres?sion of FOXQ1 or with low expression of FOXQ1（18.52%vs 66.67%，χ2=9.737，P＜0.05）.The 5-year survival rates were significantly higher with high expression of E-cadherinor low expression of E-cadherin（59.09%vs 10.00%，χ2=10.996，P＜0.05）.A multivariate Cox's proportional hazard regression analysis indicated that high FOXQ1 expression，low E-cadherin expression and lymph node metastasis were independent prognostic factors for ESCC.ConclusionThe expression of FOXQ1 and E-cadherin showed a good correlation with ESCC.And examining expressions of both FOXQ1 and E-cadherin in ESCC may have practical values in estimating the prognosis of ESCC and directing future treatment.

esophageal neoplasms；carcinoma，squamous cell；cadherins；prognosis；immunohistochemistry；forkhead box Q1；E-cadherin

R735.1

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.015

1天津醫科大學研究生院（郵編300070）；2天津市胸科醫院胸外科，3病理科

于海峰（1987），男，碩士在讀，主要從事食管癌臨床及基礎研究

△E-mail:zhangxun69@163.com