間歇低氧對大鼠肺組織RhoA/ROCK通路及肺血管新生肌化的影響

楊曉琨，高夢麗，劉亞萌，李彩麗，曹潔，馮靖

間歇低氧對大鼠肺組織RhoA/ROCK通路及肺血管新生肌化的影響

楊曉琨，高夢麗，劉亞萌，李彩麗，曹潔△，馮靖△

目的探討間歇低氧（IH）對大鼠肺組織RhoA/ROCK通路及肺血管新生肌化的影響。方法將40只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為對照組和IH組各20只，對照組：間歇正常氧暴露（21%O2）；IH組：IH暴露（5%～21%O2），持續(xù)4周。暴露結(jié)束后，2組均采用Real-time PCR和Western blot檢測肺組織RhoA、ROCK mRNA和蛋白表達(dá)情況，免疫組化法測定肺組織和肺動(dòng)脈的增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（SM-α-actin）的表達(dá)情況。結(jié)果IH組肺組織RhoA mRNA（0.463±0.067 vs 0.182±0.040）、ROCK mRNA（0.384±0.062 vs 0.192±0.052）、RhoA蛋白（0.827±0.065 vs 0.424±0.075）及ROCK蛋白（0.488±0.088 vs 0.336±0.102）表達(dá)水平均高于對照組（均P＜0.05）；IH組肺組織PCNA［（54.67±1.80）%vs（9.14±0.91）%］、肺動(dòng)脈PCNA［（49.40±1.21）%vs（8.38±1.13）%］、肺組織SM-α-actin［（42.66±1.63）%vs（35.44±1.41）%］與肺動(dòng)脈SM-α-actin［（62.62±2.53）%vs（45.54±2.58）%］表達(dá)水平均明顯高于對照組（均P＜0.05）。結(jié)論RhoA/ROCK傳導(dǎo)通路在IH所致肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中可能起著重要作用；IH可通過促進(jìn)肺動(dòng)脈的新生肌化進(jìn)一步促進(jìn)肺動(dòng)脈壓力升高。

缺氧；高血壓，肺性；增殖細(xì)胞核抗原；肌動(dòng)蛋白類；間歇低氧；肺動(dòng)脈高壓；RhoA/ROCK

阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）是一種常見的睡眠呼吸疾病，特征為反復(fù)發(fā)生上氣道塌陷而導(dǎo)致慢性間歇低氧（IH）［1］。而肺動(dòng)脈高壓（PH）是一類以肺動(dòng)脈壓力增高，伴有或不伴有肺小動(dòng)脈病變的惡性肺血管疾病。有研究發(fā)現(xiàn)OSA是PH產(chǎn)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一［2］。RhoA/ROCK信號(hào)通路是近年的研究熱點(diǎn)，在低氧性肺血管收縮與重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。近期有文獻(xiàn)報(bào)道，在PH中新生肌化是肺動(dòng)脈壓力增加的最主要來源［3］。但目前對IH影響PH中肺組織RhoA/ROCK通路表達(dá)及肺血管新生肌化的系統(tǒng)性研究較少，本研究通過建立IH的大鼠模型以模擬OSA，研究大鼠肺組織RhoA/ROCK通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)及肺血管新生肌化情況，探討其在PH發(fā)病過程中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性Wistar大鼠40只，4周齡，體質(zhì)量120～150 g，購自中國科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK津2010-0002）。

1.1.2主要儀器和試劑氧濃度監(jiān)測儀（瑞士夏美頓公司）；低流量流速表（余姚工業(yè)自動(dòng)化儀表廠）；氧氣減壓器（天津減壓器廠）；血?dú)夥治鰞x（瑞士羅氏AVL995）；光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS BX4.0）；數(shù)碼相機(jī)（日本佳能3301）；RhoA、Rho激酶引物序列（北京華大引物公司）；梯度PCR儀（Bio-Rad公司）；Real-time PCR儀（Lightcycle Roche公司）；RNA濃度測定儀（環(huán)亞生物科技有限公司）；電泳儀（美國PowerPac Ba?sic Bio-Rad公司）；石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）；RhoA抗體、ROCK抗體（美國Cell Signaling公司）；GAPDH羊抗兔多克隆抗體（美國EarthOx公司）；兔抗鼠PCNA多克隆抗體、兔抗鼠SM-α-actin多克隆抗體（EPIT MICS公司）；即用型SP免疫組化通用試劑盒（天津市津脈基因測繪技術(shù)有限公司）；羊抗兔多克隆抗體（EARTHOX公司）；二氨基聯(lián)胺苯（DAB）試劑盒（北京中杉金橋公司）。

1.2方法

1.2.1睡眠間歇低氧大鼠模型的建立將40只大鼠分為2組：對照組（20只），通過自行研制模擬OSA模式間歇低氧/再氧合（IH/ROX）氣體環(huán)境系統(tǒng)，向間歇低氧艙內(nèi)脈沖式?jīng)_入空氣，氧濃度為21%。IH組（20只），向艙內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)夂涂諝猓總€(gè)循環(huán)120 s，即30 s充入氮?dú)猓?0 s充入空氣。以上處理均在大鼠睡眠時(shí)間（每天9:00～17:00）進(jìn)行，持續(xù)4周。

1.2.2預(yù)實(shí)驗(yàn)血?dú)庵禍y定［4］暴露結(jié)束后，每組各取5只大鼠測定動(dòng)脈血pH值、二氧化碳分壓［p（CO2）］、氧分壓［p（O2）］和動(dòng)脈血氧飽和度（SaO2）。

1.2.3實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的留取各組剩余大鼠均用腹主動(dòng)脈放血法處死，迅速取出大鼠肺組織，并將右肺下葉少血部位切成1 cm×0.5 cm組織塊，液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4Real time-PCR檢測肺組織RhoA、ROCK mRNA表達(dá)水平引物設(shè)計(jì)見表1。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃10 s，60℃1 min，72℃20 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。以GAPDH為內(nèi)參來校正目的基因的表達(dá)量，結(jié)果以目的基因表達(dá)量/GAPDH基因表達(dá)量來表示，重復(fù)3次取平均值。

Tab.1　Primers used for real-time-PCR表　1Real-time-PCR引物

1.2.5Western blot法檢測肺組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)水平取解凍后肺組織（約0.2 g）加入1.5 mL細(xì)胞裂解液，勻漿、低溫離心（3 000 r/min），取上清液用BCA法蛋白定量后將蛋白變性備用。SDS-PAGE蛋白電泳獲得圖像后用Im?age J軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目標(biāo)條帶蛋白與GAPDH表達(dá)的灰度值的比值。

1.2.6免疫組化法檢測肺組織和肺動(dòng)脈中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（SM-α-actin）的表達(dá)取解凍肺組織放入4%的多聚甲醛中固定72 h，免疫組化染色操作按SP試劑盒說明書進(jìn)行，并用DAB顯色，SM-α-actin稀釋比例為1∶1 000，PCNA稀釋比例為1∶100，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。（1）PCNA表達(dá)結(jié)果判讀：以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性細(xì)胞。每張切片任意選擇5個(gè)高倍鏡視野（×400），測量每個(gè)視野下陽性細(xì)胞的百分比后取均值。（2）SM-α-actin表達(dá)結(jié)果判讀：陽性表達(dá)為胞漿內(nèi)有細(xì)絲狀棕黃色著色。肺血管重構(gòu)時(shí)肌化的程度以完全肌化的血管數(shù)目占肺小血管總數(shù)的百分比來表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1預(yù)實(shí)驗(yàn)血?dú)夥治鼋Y(jié)果2組大鼠動(dòng)脈血pH值均在正常范圍，IH組低氧結(jié)束后SaO2低于0.9，p（O2）下降至（50.00±2.74）mm Hg，表明IH模型建立成功，見表2。

Tab.2　The values of arterial blood gas in two groups表2　2組動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果　（n=5，±s）

Tab.2　The values of arterial blood gas in two groups表2　2組動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果　（n=5，±s）

1 mmHg=0.133 kPa

組別對照組IH組pH值7.410±0.012 7.406±0.011 p（CO2）（mmHg）39.20±2.39 34.60±0.89 p（O2）（mmHg）109.00±3.81 50.00±2.74 SaO20.992±0.005 0.864±0.018

2.2肺組織RhoA、ROCK mRNA和蛋白表達(dá)水平IH組肺組織RhoA、ROCK的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組（均P＜0.05），見表3。

Tab.3　RhoA/ROCK pathway in two groups表3　2組RhoA/ROCK表達(dá)水平比較　（n=5，±s）

Tab.3　RhoA/ROCK pathway in two groups表3　2組RhoA/ROCK表達(dá)水平比較　（n=5，±s）

＊P＜0.05

組別對照組IH組t mRNA RhoA 0.182±0.040 0.463±0.067 7.200＊ROCK 0.192±0.052 0.384±0.062 4.751＊蛋白R(shí)hoA 0.424±0.075 0.827±0.065 11.427＊ROCK 0.336±0.102 0.488±0.088 3.195＊

2.3肺組織和肺動(dòng)脈中PCNA及SM-α-actin表達(dá)水平比較IH組肺組織和肺動(dòng)脈的PCNA及SM-α-actin表達(dá)水平明顯高于對照組（均P＜0.05），見表4。

Tab.4　The SM-α-actin and PCNA expression in lung and pulmonary artery in two groups表4　2組肺組織和肺動(dòng)脈中PCNA及SM-α-actin表達(dá)水平比較　（n=5，±s）

Tab.4　The SM-α-actin and PCNA expression in lung and pulmonary artery in two groups表4　2組肺組織和肺動(dòng)脈中PCNA及SM-α-actin表達(dá)水平比較　（n=5，±s）

＊P＜0.05

組別對照組IH組t PCNA（%）肺組織9.14±0.91 54.67±1.80 71.432＊肺動(dòng)脈8.38±1.13 49.40±1.21 78.619＊SM-α-actin（%）肺組織35.44±1.41 42.66±1.63 10.586＊肺動(dòng)脈45.54±2.58 62.62±2.53 14.980＊

3　討論

PH是指肺內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生的高血壓，OSA的肺高壓屬于第3大類與呼吸系統(tǒng)疾病或缺氧相關(guān)的PH［3］。研究發(fā)現(xiàn)PH的病理學(xué)改變包括內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、增殖、肺血管平滑肌細(xì)胞的高反應(yīng)性增生及炎癥細(xì)胞的遷移和黏附［5］。目前認(rèn)為低氧和CO2潴留所誘導(dǎo)的肺血管收縮、血管內(nèi)皮功能下降及呼吸暫停期間的氣管內(nèi)負(fù)壓增加是OSA患者形成PH的主要原因［6］。本研究中預(yù)實(shí)驗(yàn)血?dú)夥治鼋Y(jié)果顯示，IH組大鼠p（O2）和SaO2均周期性降低及恢復(fù)正常，可模擬OSA模式IH暴露環(huán)境。

RhoA/ROCK通路的關(guān)鍵信號(hào)分子包括Rho蛋白、ROCK和肌球蛋白磷酸酶（MLC）。Xu等［7］研究發(fā)現(xiàn)ROCK特異性的抑制劑Y-27632可顯著降低缺氧所導(dǎo)致的新生小鼠的右心室肥厚，逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈血管壁的重建，同時(shí)減少縮血管物質(zhì)內(nèi)皮素-1（ET-1）和內(nèi)皮素-A（ET-A）的受體。RhoA/ROCK的作用是復(fù)雜的，缺血再灌注損傷后ROCK活性增加，并且促進(jìn)白細(xì)胞浸潤，從而參與早期炎癥反應(yīng)［8］，ROCK抑制劑法舒地爾可顯著減輕內(nèi)皮損傷，并促進(jìn)肺血管重建及阻止慢性低氧介導(dǎo)的肺動(dòng)脈壓力增高［9］；還有研究認(rèn)為Rho抑制劑C3胞外酶可顯著減弱內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）遷移、黏附等功能，并降低體外血管形成的能力［10］。低氧可以誘導(dǎo)RhoA/ROCK通路的活化，而RhoA/ROCK通路異常活化又為PH發(fā)生的重要起始環(huán)節(jié)之一［11］。RhoA/ROCK通路還可通過破壞內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA的穩(wěn)定性導(dǎo)致一氧化氮（NO）合成減少，從而增強(qiáng)肺血管收縮，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓的升高［12］。RhoA/ROCK通路可能就是通過這些機(jī)制在OSA患者PH的形成中發(fā)揮重要作用。本研究顯示在IH大鼠模型中肺組織RhoA、ROCK mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組，與有關(guān)研究結(jié)果一致［13］，由此筆者推測，缺氧是IH暴露導(dǎo)致PH的重要因素，而在缺氧引起的肺血管收縮和重建中，Rho/ROCK通路表達(dá)可能發(fā)揮重要作用，近期還有研究發(fā)現(xiàn)血循環(huán)中中性粒細(xì)胞RhoA/ROCK通路表達(dá)活性可以作為判斷早期PH的指標(biāo)［14］。

PH主要的病理生理改變?yōu)榉窝艿氖湛s和重塑（包括平滑肌的增生及小動(dòng)脈的新生等）［3］。而血管的新生肌化主要表現(xiàn)為原位平滑肌細(xì)胞（SMC）的增殖和遷徙、干細(xì)胞的分化、纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞獲得平滑肌細(xì)胞的表型等。PCNA是一種僅在增殖細(xì)胞中合成或表達(dá)的核內(nèi)多肽，是一種可靠的評價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)［15］。有研究發(fā)現(xiàn)IH大鼠肺血管細(xì)胞中PCNA的表達(dá)顯著增加，PCNA的表達(dá)量與SMC的增殖活力呈正相關(guān)［16］。近年來研究發(fā)現(xiàn)PC?NA還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡及自然殺傷細(xì)胞的激活。SM-α-actin是干細(xì)胞向初始SMC分化的標(biāo)志，SM-α-actin基因的表達(dá)高低與SMC的分化程度密切相關(guān)［17］。由此筆者推測測定肺血管PCNA及SM-α-actin的表達(dá)可有效反映肺血管平滑肌的增殖、收縮及肺血管的新生肌化情況，而肺血管的收縮及新生肌化又是肺動(dòng)脈壓力升高的主要原因。因此測定肺血管PCNA及SM-α-actin的表達(dá)可在一定程度上反映肺動(dòng)脈壓力的變化。

Sajkov等［2］研究發(fā)現(xiàn)IH可導(dǎo)致動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，經(jīng)過數(shù)周IH的大鼠可出現(xiàn)明顯的肺動(dòng)脈重構(gòu)。de Fruto等［18］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IH增加平滑肌細(xì)胞SM-α-actin表達(dá)，進(jìn)而增加動(dòng)脈壁厚度引起動(dòng)脈重建。而PCNA可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致血管壁肥厚及管腔狹窄，進(jìn)而引起動(dòng)脈壓力的升高。這些均與肺動(dòng)脈新生肌化導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓力增高密切相關(guān)。本研究通過測定模型大鼠肺組織和肺動(dòng)脈中PCNA及SM-α-actin表達(dá)情況來反映肺動(dòng)脈壓力的升高情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IH組大鼠肺組織及肺動(dòng)脈的PCNA及SM-α-actin表達(dá)水平均明顯高于對照組，推測IH可引起大鼠肺血管平滑肌的增殖、肺血管新生肌化及收縮能力的增強(qiáng)。

綜上，RhoA/ROCK通路可能在低氧性血管收縮及肺血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，若能及早抑制RhoA/ROCK通路激活，從而減輕低氧血管收縮及肺血管重構(gòu)，減緩PH的進(jìn)展，可為預(yù)防和控制OSA并發(fā)PH提供新思路。

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（2014-09-29收稿2014-10-20修回）

（本文編輯閆娟）

Effect of intermittent hypoxia on RhoA/ROCK pathway in lung and on the muscularization in pulmonary vascular in rat model

YANG Xiaokun，GAO Mengli，LIU Yameng，LI Caili，CAO Jie△，F(xiàn)ENG Jing△
Department of respiratory，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China
△Corresponding AuthorE-mail:tjcaojie@sina.com；zyyhxkfj@126.com

ObjectiveTo explore the effect of intermittent hypoxia（IH）on RhoA/ROCK pathway in lung and on the muscularization in pulmonary vascular in rat model.MethodsWistar rats（n=40）were randomly divided into two groups: the normal oxygen control group（n=20）and the IH group（n=20）.For 4 weeks，rats in control group and IH group were ex?posed to intermittent normal oxygen（21%O2）or IH（5%-21%O2）respectively.Then，mRNA transcription and protein trans?lation levels of RhoA/ROCK were examined by Real-time PCR and Western blot.Expression of proliferation cell nuclear an?tigen（PCNA）and α-smooth muscle actin（SM-α-actin）of lung and pulmonary artery were detected by immunohistochemis?try.ResultsRhoA mRNA transcription level（0.463±0.067 vs 0.182±0.040），ROCK mRNA transcription level（0.384± 0.062 vs 0.192±0.052），RhoA protein expression level（0.827±0.065 vs 0.424±0.075）and ROCK protein expression level （0.488±0.088 vs 0.336±0.102）were higher in IH group than those in control group（P＜0.05）；Levels of PCNA in lung tissue［（54.67±1.80）%vs（9.14±0.91）%］，PCNA in pulmonary artery［（49.40±1.21）%vs（8.38±1.13）%］，SM-α-actin in lung tis?sue［（42.66±1.63）%vs（35.44±1.41）%］and SM-α-actin in pulmonary artery［（62.62±2.53）%vs（45.54±2.58）%］were also higher in IH group than those in control group（P＜0.05）.ConclusionRho/ROCK pathway may play an important role in developing pulmonary hypertension（PH）associated with IH；and IH can promote the muscularization in pulmonary vascular to accelerate PH.

anoxia；hypertension，pulmonary；proliferating cell nuclear antigen；actins；intermittent hypoxia；pulmonary hypertension；RhoA/ROCK

R56

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81270144，30800507，81170071）

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸科（郵編300052）

楊曉琨（1988），女，碩士在讀，主要從事睡眠低氧性疾病研究

△E-mail:tjcaojie@sina.com；zyyhxkfj@126.com