回神顆粒含藥腦脊液干預PC12損傷細胞凋亡時間窗的實驗研究*

★　張玉嶺　劉丹　指導：陳寶貴 （天津中醫藥大學附屬武清中醫醫院　天津301700）

回神顆粒含藥腦脊液干預PC12損傷細胞凋亡時間窗的實驗研究*

★張玉嶺**劉丹指導：陳寶貴 （天津中醫藥大學附屬武清中醫醫院天津301700）

目的：探討回神顆粒含藥腦脊液體外對缺血缺氧損傷的PC12細胞的保護作用，并探討其作用的時間窗，為進一步開展臨床研究提供依據。方法：采用腦脊液藥理學和PC12細胞培養的方法，用回神顆粒含藥腦脊液體外培養缺血缺氧損傷的PC12細胞。在PC12細胞損傷后6h、12h、24h、72h，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果：PC12細胞模型復制后，神經細胞凋亡在0～72h都有動態變化；回神顆粒含藥腦脊液干預的PC12細胞凋亡時間窗0～24h是最佳干預時機，0～72h內仍有意義。結論：回神顆粒含藥腦脊液可抑制神經細胞凋亡，其最佳時間窗為0～24 h。

腦脊液；回神顆粒；時間窗；細胞凋亡

創傷性顱腦損傷（TBI）是腦血管病中最嚴重的一種，其發病率高，病死率高，致殘率高，是當今世界上造成死亡和傷殘的重要原因，尤其是兒童和年輕人。流行病學資料統計顯示，TBI占全身各部位損傷的9%～21%［1-4］。

回神顆粒由全國名中醫專家，博士生導師，享受國務院特殊津貼專家，全國第三批名老中醫經驗繼承指導老師，首屆中醫藥傳承特別貢獻獎獲得者，中華中醫藥學會老年病分會副主任委員陳寶貴教授經過40多年的臨床及實驗研究研制而成，臨床應用于高血壓性腦出血急性期、創傷性顱腦損傷等療效顯著，可有效降低致殘率，提高生存質量［5］。

回神顆粒主要以鹿角、丹參、菖蒲、靈芝、郁金等藥物組成。該藥補益五臟精氣，兼以化郁、祛痰、消瘀，從而調整五臟功能，達到治療目的。本實驗旨在探討口服中藥回神顆粒在體內代謝后，從細胞凋亡的角度，研究含藥腦脊液對體外培養的受損PC12細胞的保護作用，并探討其作用的時間窗，為進一步開展臨床研究提供依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物大耳家兔，60只，體重（2±0.5）kg，雄性，由軍事醫學科學院提供。

1.2藥品、試劑和儀器中藥回神顆粒，由天津武清中醫醫院提供。多聚賴氨酸 （Sigma），DMEM培養基（Sigma）。PC12細胞為神經生長因子誘導分化型，由本院醫學實驗科保存。胰蛋白酶（GIBCO）、小牛血清、胎牛血清（杭州四季青公司），噻唑蘭（MTT）（Sigma），二甲基亞砜 （DMSO）（上海生工生物工程有限公司），碘化丙啶（PI）染液（Sigma），流式細胞儀（COULTER）。

1.3含藥腦脊液制備大耳白家兔6只，空白組和給藥組各3只，體重（2±0.5）kg，雄性，適應性喂養3d后給藥，給藥組按成人劑量折算給藥；空白組給服等體積的生理鹽水。灌胃后1h，戊巴比妥鈉靜脈麻醉，于無菌條件下在枕骨大孔處垂直進針，抽取200μL腦脊液，并補充等量生理鹽水，以上步驟重復3d，把3d獲得的同一家兔的腦脊液混合，-70℃凍存備用。

1.4細胞培養PC12細胞用含10%胎牛血清、青霉素100 kU/L和鏈霉素100 kU/L的DMEM/F12培養基在玻璃培養瓶中培養，CO2細胞培養箱的培養條件為37℃，5%CO，飽和濕度，待細胞長至80%豐度后用0.25%的胰酶消化傳代1次（2～3 d），倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況，實驗時取對數生長期細胞進行實驗。進行MTT實驗前，將細胞接種到96孔培養板用無血清培養基培養；流式細胞儀檢測前，將細胞接種至6孔培養板用無血清培養基培養；免疫組化實驗均用24孔培養板爬片法培養細胞，培養基為無血清培養基。

1.5細胞分組當培養的細胞處于對數生長期時，將細胞分為8組：①正常對照組，不加任何處理因素，換同體積新鮮的無血清DMEM/F12培養基；②空白腦脊液組，置換含正常大耳白家兔空白腦脊液的無血清培養液，傾去原培養基，用預熱的DPBS漂洗細胞3次，加入無糖無血清的DMEM培養基，置于厭氧培養箱中培養6h；③OGD/R模型組，傾去原培養基，用預熱的DPBS漂洗細胞3次，加入無糖無血清的DMEM培養基，置于厭氧培養箱中培養6h。④含藥腦脊液組，根據作用時間的不同（6h、12h、24h、48h、72h）分別分為5個小組。造模后，分別加入含藥腦脊液繼續6h、12h、24h、48h、72h。

1.6MTT法檢測PC12細胞存活取對數生長期的PC12細胞，用0.125%胰蛋白酶消化后調節細胞密度為1×108/L接種于96孔板中，每孔100μL，無血清培養24 h，然后按照上述分組方法進行藥物干預，每組設6復孔［6］。6h、12h、24h、48h、72h后，每孔加入5μg/L 的MTT溶液20μL繼續在CO2培養箱中孵育4h，然后取出96孔培養板，棄去上清液，每孔加入150μL 的DMSO，置于搖床上振蕩10min，待紫色結晶完全溶解后用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的吸光度值 （A490nm）。細胞存活率 （%）=A490 nm（實驗）/A490 nm（對照）×100%［8-12］。

1.7流式細胞儀檢測細胞凋亡率取對數生長期的PC12細胞，用0.125%胰蛋白酶消化后調節密度為1×108/L接種于96孔板中，每孔2 mL，無血清培養，然后按照上述分組方法進行藥物干預，每組設6復孔。24 h后，用細胞凋亡檢測試劑盒內的緩沖液300μL重懸，加入5μLAnnexinⅤ-FITC混勻后，再加入5μL PI混勻，室溫避光反應10min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率［7］，結果見表1。

表1　不同時點PC12細胞凋亡率的比較　%

2　結果

2.1缺氧環境下PC12細胞形態學觀察神經細胞接種后6 h開始貼壁，貼壁細胞以分散或成團形式存在。24 h后細胞伸出粗細不等的突起；72 h后，神經細胞開始呈錐體狀、卵圓狀或梭形等狀態，突起分支細長，光暈明顯，大多數細胞折光強，但中心部分較暗。如果不加阿糖胞苷抑制非神經元細胞生長，則在1周時鋪滿培養瓶，細胞突起互相聯接呈網格狀、地毯樣。如果在72 h加阿糖胞苷干預，則僅有神經元細胞生長。

損傷的PC12細胞逐漸退化，胞體腫脹，出現沉積，神經突起斷裂，神經元崩解，壞死的神經元漂浮在培養液上層。隨著時間的增加，細胞的損傷逐漸加重。缺血缺氧損傷后，PC12細胞的損傷壞死更加嚴重。回神顆粒含藥腦脊液處理后的PC12細胞，能明顯改善糖氧剝奪后細胞形態學改變，表現為減少細胞突起結構的消失，減少細胞碎片的形成。

2.2回神顆粒含藥腦脊液對氧糖剝奪/再灌注損傷的PC12細胞模型不同時間點細胞凋亡的影響受損PC12細胞損傷開始6 h，神經細胞開始凋亡，隨著損傷時間的延長，細胞的凋亡率也在上升，到24 h達高峰（52.2%）。超過24 h后慢慢下降，72 h仍未恢復至6 h水平。給藥組可以明顯減少PC12細胞損傷后的凋亡率，推遲凋亡高峰出現的時間，其峰值在48 h出現。說明回神顆粒含藥腦脊液可以延遲損傷的PC12細胞的凋亡時間窗。

3　討論

我們在醫療實踐中，充分發掘中醫藥優勢，根據中醫辨證理論，在病程早期以中藥介入治療，研究回神顆粒治療創傷性顱腦損傷的時間窗，最大限度地搶救受損的神經細胞，減輕神經功能缺損程度，已成為一種前沿的治療趨勢。

實驗研究表明，損傷的PC12細胞模型在損傷6 h開始凋亡，24 h達到凋亡高峰，48～72 h仍然維持較高的水平。回神顆粒含藥腦脊液可以在0～72 h各時間點抑制神經細胞的凋亡，但時間越早，其細胞凋亡率越低，提示干預時機越早，細胞的凋亡損傷越小。研究證明：回神顆粒可以推遲神經細胞凋亡高峰的出現，說明中藥回神顆粒有延長神經細

胞凋亡時間窗的作用。本實驗結果證明，回神顆粒可能使受到損害的神經元恢復其正常生理功能，最大限度地保留神經功能，且在24 h內進行干預是最佳時機，72 h內治療可能仍有意義。

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全國名老中醫傳承工作室建設項目（國中醫藥人教發［2011］41號）。

**第一作者：張玉嶺（1986-），女，博士，醫師。研究方向：中醫治療腦病。Tel：15122588780，E-mail：niki19860717@163.com。

（2014-05-07）編輯：萬崇毅