DBS法與傳統采樣法用于人體藥物代謝動力學試驗的比較研究*

倪天慶，司端運，胡思源，魏廣力，夏媛媛

·臨床論著·

DBS法與傳統采樣法用于人體藥物代謝動力學試驗的比較研究*

倪天慶1，司端運2，胡思源1，魏廣力2，夏媛媛2

（1.天津中醫藥大學第一附屬醫院，國家藥物臨床試驗機構，天津300193；2.天津藥物研究院，釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室，天津300301）

［目的］探討干血點采樣（DBS）法在熱毒寧注射液藥物代謝動力學試驗中的應用，并與傳統的血漿采集方法結果進行比較。［方法］從志愿者肘靜脈取血，一部分進行LC-MS/MS定量分析，剩余全血分離血漿，進行梔子苷、山梔苷以及京尼平龍膽雙糖苷的血藥濃度分析。色譜柱Ecosil C18（150mm×4.6mm，5μm），流動相甲醇，20mmol/L甲酸銨，0.1%甲酸，10%甲醇，流速0.5mL/min，進樣量10μL。質譜檢測采用ESI離子源，MRM正離子檢測模式，質譜運行采集時間11m in。［結果］單次靜脈滴注熱毒寧注射液，DBS法測定3種梔子成分全血濃度經血細胞比容校正后，梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷的達峰時間（Tmax）分別為1.41、1.47、1.47 h。峰濃度（Cmax）分別為4.580、0.285、0.550μg/mL。濃度-時間曲線下的面積（AUC0-t）分別為9.060、0.638、1.200（μg·h）/m L。平均駐留時間（MRT0-t）分別為1.52、1.49、1.45 h。［結論］山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷血漿法和DBS法（校正后）計算的血藥濃度和藥代參數較為一致，表明DBS法在藥物穩定性成分的藥物代謝動力學研究中可替代傳統血漿處理方法。

DBS法；熱毒寧注射液；梔子苷；藥物代謝動力學；比較研究。

干血點采樣（DBS），是將全血樣品點在特制卡紙上的一種生物樣品采集新技術，比傳統方法具有很多優勢，并可節省大量研究經費［1］。DBS法與液質聯用技術在藥物定量分析中已成為一個重要方法，但還不夠完善［2-3］。本試驗采用DBS法與傳統靜脈血漿采樣法同時取樣，比較分析熱毒寧注射液中梔子類成分，在健康人體內的藥時曲線和藥代參數，從而為DBS法的推廣應用提供參考。

1　材料

1．1藥品與試劑熱毒寧注射液：每支10mL，江蘇康緣藥業股份有限公司生產，生產批號130410。梔子苷：含量99.7%，中檢所，批號110749-201115，山梔苷：含量98.36%，中檢所，批號100825，京尼平龍膽雙糖苷：含量98.25%，中檢所，批號100422，桃葉珊瑚苷（內標）：含量99.5%，中檢所，批號111761-200601。甲醇、乙腈均為色譜純。

1.2儀器美國AB Sciex公司，API 5500型液相色譜-三級四極桿質譜聯用儀，配有電噴霧離子源（ESI）；日本Shimadzu公司液相色譜系統。梅特勒-托利多公司XS-105型分析天平。美國Thermo電子公司17R型冷凍離心機。美國Zymark公司Turbo Vap LV型樣品濃縮儀。北京踏錦科技有限公司VX-Ⅱ型Targin Tech多管渦旋振蕩器。

2　試驗方法

2.1受試者的選擇納入標準［4］：1）健康志愿者，男女各半。2）年齡：18～40歲。3）體重指數在19～24范圍內［體重指數=體質量（kg）/身高2（m2）］，且男性體質量60～70 kg、女性體質量50～60 kg。4）體格檢查及理化檢驗指標均在正常范圍。5）志愿簽暑知情同意書。排除標準：1）3個月內用過已知對人體臟器有損害的藥物。2）近1周內正在應用其他預防或治療藥物者。3）最近3個月獻血者及試驗采血者。4）懷疑或確有酒精、藥物濫用史。5）妊娠期、哺乳期及準備妊娠婦女。6）法律規定的殘疾患者。7）根據研究者判斷，不宜參加試驗者。16位健康受試者，經全面體檢，血尿便常規、肝腎功能、心電圖以及血液分析正常，符合試驗要求。受試者于試驗期間食用統一標準餐，試驗期間不得飲用碳酸飲料、咖啡、茶葉水等，避免劇烈運動。

2.2給藥方法及樣本采集受試者于試驗前1 d晚入住Ⅰ期臨床試驗病房，禁食過夜10h以上，次日晨起進食標準清淡早餐，8∶00時靜脈輸注熱毒寧注射液20mL，以5%葡萄糖注射液稀釋至250mL。使用輸液泵控制恒速滴注90min完畢，滴速為3mL/min。選擇靜脈輸注給藥前，靜脈輸注過程中0.5、1、1.5 h，靜脈輸注停藥后15、30、45min、1、1.25、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h從志愿者肘靜脈取血，每次3m L。

2.3血樣及樣品處理志愿者肘靜脈取血3mL至肝素采血管，上下搖勻，吸取40μL全血點卡2份（雙樣本，卡片放于室溫下2 h內自然晾干，然后裝入已加有干燥劑的封口袋中于4℃密封保存）。剩余全血以3 000 r/m in離心10 min，分離血漿，吸1份50μL于EP管中，再將剩余的血漿全部轉移到另一EP管中，血漿樣品直接凍入-80℃冰箱保存。吸取50μL血漿或空白血漿，50μL甲醇或50μL梔子3種成分系列混合標準工作液/QC工作液，100μL內標桃葉珊瑚苷（2μg/m L）甲醇溶液，渦旋1min，4℃12000 r/m in離心10min。取上清液100μL加50μL去離子水，渦旋1min，吸取100μL至內插管，進樣10μL進行LC-MS/MS定量分析。

從全血點卡上，用打孔器打6mm全血紙片至2mLEP管中，加入400μL內標桃葉珊瑚苷（320ng/mL，甲醇∶水=70∶30配制）溶液，超聲30min，吸取上清液300μL，40℃氮氣吹干，用100μL復溶溶液（甲醇∶水=50∶50）渦旋1 min復溶，4℃12 000 r/m in離心5min，進樣10μL進行LC-MS/MS定量分析。

精密稱取梔子苷標準品、山梔苷標準品和京尼平龍膽二糖苷標準品5.00、4.99、5.00mg，分別置于3個5mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，分別獲得1mg/mL的梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽二糖苷3種標準品儲備液［6］。用甲醇配制梔子5種待測成分的混合標準貯備液，隨后用甲醇梯度稀釋成濃度為0.01/0.005（梔子苷濃度為0.01μg/mL，山梔苷、京尼平龍膽二糖苷濃度均為0.005μg/mL，以下同此）、0.02/0.01、0.1/0.05、0.5/0.25、2/1、10/5、25/12.5μg/mL的梔子3種成分混合標準系列工作液。精密稱取桃葉珊瑚苷（內標）標準品4.46mg于10m L的容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得桃葉珊瑚苷濃度為446μg/mL的標準貯備液，并進一步用甲醇稀釋為2μg/mL的標準工作溶液。所有溶液置于4℃保存備用。

應用LC-MS/MS方法測定人血漿中梔子苷、山梔苷以及京尼平龍膽雙糖苷的含量。人血漿中梔子苷定量分析的線性范圍為0.01～25μg/mL，LLOQ為0.01μg/mL，人血漿中山梔苷和京尼平龍膽雙糖苷定量分析的線性范圍為0.005～12.5μg/m L，LLOQ為0.005μg/mL。在低、中、高3個濃度水平下批內精密度（RSD）小于5.38%，批間精密度（RSD）小于8.30%，準確度（RE）在0.5%～7.4%之間。梔子苷等成分的基質效應在96.5%～104.0%之間，回收率在94.7%～98.8%之間。

應用LC-MS/MS方法測定DBS樣品中梔子苷、山梔苷以及京尼平龍膽雙糖苷的含量。DBS樣品中梔子苷定量分析的線性范圍為0.02～25μg/mL，LLOQ為0.02μg/mL，DBS樣品中山梔苷和京尼平龍膽雙糖苷定量分析的線性范圍為0.01～12.5μg/mL，LLOQ為0.01μg/mL。在低、中、高3個濃度水平下批內精密度（RSD）小于5.00%，批間精密度（RSD）小于11.8%，準確度（RE）在3.0%～12.0%之間。梔子苷等成分的基質效應在93.5%～104.0%之間，回收率在97.1%～116.0%之間。

2.4測定梔子苷等成分的色譜與質譜條件色譜柱：EcosilC18（150mm×4.6mm）。流動相：A甲醇，B 20 mmol/L甲酸銨，0.1%甲酸，10%甲醇。梯度：0min～7min，85%B→60%B；7min～9min，60%B→20%B；9min～11min，20%B→20%B；11min～11.1min，20%B→85%B；11.1 min～15 min，85%B。流速：0.5mL/min，保留時間：桃葉珊瑚苷4.53min，山梔苷5.44min，京尼平龍膽二糖苷8.01min，梔子苷9.68min。卷簾氣：14 psi，碰撞氣：8 psi，噴霧電壓：4 500 V，源溫度：500℃Gas1：80 psi，Gas2：40 psi，入口電壓：10V，碰撞出口電壓：10V，質譜運行采集時間：11min。

2.5數據處理根據試驗中測得的各受試者的血藥濃度-時間數據繪制各受試者的藥-時曲線及平均藥-時曲線，進行藥物代謝動力學參數的估算，求得藥物的主要藥物代謝動力學參數［7］，包括：達峰時間（Tmax，實測值）、峰濃度（Cmax，實測值）、平均濃度-時間曲線下的面積（AUC0-t）、藥時曲線下總面積（AUC0-∞）、表觀分布容積（Vd）、半衰期（t1/2）、平均駐留時間（MRT0-t）、總清除率（CL）等，采用WinNonlin 6.3軟件進行分析，并對計量資料進行配對t檢驗分析。

3　結果

3.1梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法血藥濃度比較見表1。

3.2梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法藥代參數比較見表2。

4　討論

熱毒寧注射液由青篙、金銀花、桅子組成，具有清熱、疏風、解毒之功，用于外感風熱所致的高熱、微惡風寒、頭痛身痛、咳嗽等癥，是治療上呼吸道感染的純中藥注射劑，其中梔子苷與綠原酸做為質量檢測指標［8］。但其中綠原酸類成分由于在空氣中易于氧化、不穩定，無法用于DBS法的含量檢測，故僅選擇梔子苷類成份進行比較分析。中藥藥物代謝動力學研究，較化學藥物的研究更為困難，一直是研究的熱點和重點問題［9］。液相色譜串聯質譜聯用，使得分析速度快、選擇性好、簡便、精確、靈敏度高的特點，適用于多組分藥物代謝動力學研究［10］。

表1　梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法血藥濃度的比較（±s）Tab.1　Com parison of theblood drug concentrationsof geniposide，shanzhiside，genipin gentian diglucoside in human plasma and DBS（±s）　μg/mL

表1　梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法血藥濃度的比較（±s）Tab.1　Com parison of theblood drug concentrationsof geniposide，shanzhiside，genipin gentian diglucoside in human plasma and DBS（±s）　μg/mL

注：與傳統法比較，*P＜0.05。

時間（h）　　梔子苷　　山梔苷　　京尼平龍膽雙糖苷傳統法　DBS法　　傳統法　DBS法　　傳統法　DBS法0.00 0　0　0　0　0　0 0.50　2.770±0.564　2.740±0.618*　0.140±0.028　0.138±0.033*　0.272±0.059　0.278±0.069* 1.00　3.880±0.642　3.830±0.741*　0.232±0.036　0.226±0.044*　0.444±0.084　0.439±0.086* 1.50　4.420±0.527　4.530±0.747*　0.287±0.034　0.284±0.046*　0.538±0.068　0.544±0.090* 1.75　2.480±0.429　2.630±0.556*　0.219±0.030　0.209±0.039*　0.403±0.069　0.390±0.074* 2.00　1.550±0.367　1.790±0.437*　0.174±0.029　0.169±0.034*　0.310±0.060　0.309±0.064* 2.25　1.080±0.218　1.330±0.314*　0.144±0.022　0.139±0.031*　0.255±0.043　0.253±0.057* 2.50　0.841±0.179　1.110±0.246*　0.123±0.020　0.119±0.024*　0.217±0.038　0.216±0.049* 2.75　0.611±0.129　0.849±0.165*　0.103±0.014　0.097±0.019*　0.182±0.033　0.172±0.037* 3.00　0.496±0.103　0.759±0.145*　0.091±0.014　0.086±0.018*　0.156±0.027　0.155±0.035* 3.50　0.330±0.091　0.578±0.130*　0.070±0.013　0.064±0.014*　0.120±0.025　0.114±0.027* 4.50　0.156±0.048　0.400±0.085*　0.040±0.009　0.036±0.010*　0.069±0.016　0.064±0.017* 5.50　0.083±0.022　0.306±0.063*　0.025±0.006　0.023±0.009　0.042±0.011　0.041±0.013* 7.50　0.027±0.008　0.204±0.047*　0.009±0.004　0.007±0.004*　0.016±0.006　0.013±0.006* 9.50　0.015±0.003　0.162±0.032*　0.004±0.002　0.002±0.002*　0.007±0.003　0.004±0.003*

表2　梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法藥代參數比較（±s）Tab.2　Comparison of the pharmacokinetic parametersof geniposide，shanzhiside，genipin gentian diglucoside in human p lasma and DBS（±s）

表2　梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法藥代參數比較（±s）Tab.2　Comparison of the pharmacokinetic parametersof geniposide，shanzhiside，genipin gentian diglucoside in human p lasma and DBS（±s）

注：與傳統法比較，*P＜0.05。

參數　　梔子苷　　山梔苷　　京尼平龍膽雙糖苷傳統法　DBS法　　傳統法　DBS法　　傳統法　DBS法t1/2（h）　0 001.420±000.269 0 003.980±000.736*0 0001.420±0 000.172 0 0001.130±0 000.195*0 0001.470±0 000.148 0 0001.200±0 000.221* Tmax（h）　0 001.410±000.202 0 001.410±000.202　0 0001.470±0 000.125 0 0001.470±0 000.125　0 0001.470±0 000.125 0 0001.470±0 000.125 Cmax（ng/mL）　0 004.490±000.438 0 004.580±000.644　0 0000.288±0 000.033 0 0000.285±0 000.044　0 0000.541±0 000.065 0 0000.550±0 000.084 AUC0-t［（μg·h）/mL］0 007.410±001.000 0 009.060±001.570*0 0000.671±0 000.090 0 0000.638±0 000.121*0 0001.220±0 000.190 0 0001.200±0 000.230 AUC0-∞［（μg·h）/mL］0 007.440±001.010 0 010.000±001.760*0 0000.679±0 000.093 0 0000.642±0 000.122　0 0001.240±0 000.193 0 0001.210±0 000.230 Vd（L）　0 005.632±001.477 0 011.711±002.605*0 0060.912±0 008.893 0 0051.916±0 008.663*0 0035.169±0 007.276 0 0029.275±0 005.823* CL（L/h）　2 736.000±372.000 2 061.000±386.000*29 950.000±3 992.000 32 259.000±6 333.000*16 575.000±2 720.000 17 228.000±3 504.000* MRT0-t（h）　0 000.856±000.072 0 001.520±000.107*00 001.589±0 000.149 00 001.490±0 000.173*0 0001.520±0 000.137 0 0001.450±0 000.143* MRT0-∞（h）　0 000.897±000.077 0 002.750±000.427*00 001.697±0 000.200 00 001.540±0 000.212*00 001.640±0 000.175 0 0001.510±0 000.189*

健康受試者單次靜脈滴注熱毒寧注射液，DBS法測定3種梔子成分的全血濃度經血細胞比容校正后，梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷的Tmax分別為1.41、1.47、1.47 h；Cmax別為4.58、0.285、0.550μg/mL；AUC0-t分別為9.06、0.638、1.20（μg·h）/mL；MRT0-t分別為1.52、1.49、1.45h；CL分別為2.06、32.3、17.2L/h；Vd分別為11.7、51.9、29.3 L；t1/2分別為3.98、1.13、1.20 h。與文獻報導的動物試驗結果有差異［11-14］。

山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷血漿法和DBS法（校正后）計算的血藥濃度和藥代參數較為一致，而梔子苷的血藥濃度數據從給藥結束后1 h起開始出現差異，從3.1可以看出，DBS法測定的血藥濃度要高于血漿法的測定結果，從藥時曲線上看，DBS梔子苷的消除下降趨勢變緩，因此導致t1/2、AUC0-t、MRT0-t均明顯高于血漿法的計算結果，產生這一結果的原因還需要進一步的研究。

圖1　梔子苷、山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷人血漿和DBS法藥時曲線比較Fig.1　Com parison of the concentration tim e curve of geniposide，shanzhiside，genipin gentian diglucoside in human p lasma and DBS

［1］LiW，Tse FL.Dried blood spot sampling in combination with LCMS/MSforquantitativeanalysisofsmallmolecules［J］.Biomed Chromatogr，2010，24（1）:49-65.

［2］Wilhelm AJ，den Burger JC，Vos RM，etal.Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.JChromatogr B，Analyt Technol Biomed Life Sci，2009，877（14-15）:1595-1598.

［3］Hoogtanders K，van der Heijden J，ChristiaansM，etal.Therapeutic drugmonitoring of tacrolimuswith the dried blood spotmethod［J］.J Pharm Biomed Anal，2007，44（3）:658-664.

［4］倪天慶，胡思源，賈景蘊，等.冬青通脈膠囊Ⅰ期臨床人體耐受性研究［J］.現代藥物與臨床，2011，26（2）:145-148.

［5］劉勇，魏廣力，谷元，等.干血點采樣技術和干血漿采樣技術在麥考酚酸藥動學分析中的應用［J］.藥物評價研究，2012，35（6）: 401-407.

［6］師永清，康淑荷，王愛軍.HPLC法同時測定黃連雙清丸中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和大黃素的含量［J］.藥物分析雜志，2013，33（9）:1612-1616.

［7］張藝竹，安叡，袁瑾，等.基于藥代動力學參數分析比較葛根芩連湯的不同配伍腸吸收特性［J］.藥學學報，2013，48（10）:1611-1617.

［8］畢宇安，孫曉萍，王振中，等.熱毒寧注射液在大鼠體內的藥代動力學研究［J］.世界科學技術中醫藥現代化，2010，12（6）:941-944.

［9］Liu CX.Difficulty and hot-points on pharmacokinetics studies of traditional Chinesemedicine［J］.Yao Xue Xue Bao，2005，40（5）: 395-401.

［10］居文政，劉芳，吳婷，等.UPLC-MS/MS法同時測定人血漿中黃芩苷和綠原酸［J］.藥學學報，2007，42（10）:1074-1077.

［11］樊天宇，文紅梅，過科家，等.通絡凍干粉針中梔子苷、芍藥苷beagle犬藥代動力學研究［J］.中藥藥理與臨床，2007，23（1）:50-53.

［12］梁忠良，江振洲，張陸勇，等.梔燈注射液中梔子苷、燈盞花素的大鼠藥代動力學初步研究［J］.中國生化藥物雜志，2009，30（6）:371-374.

［13］周永剛，藍曉紅，許銳.注射用清開靈中梔子苷在家兔體內的藥動學研究［J］.解放軍藥學學報，2010，26（4）:307-309.

［14］鄭衛華，王艷娟，梁佳佳，等.熱毒寧注射液與梔子苷單體在大鼠體內的藥動學比較［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20（3）:95-99.

（本文編輯：馬曉輝，高杉）

DBSmethodw ith traditionalsamp lingmethod for com parative study ofhuman pharmacokinetics test

NITian-qing1，SIDuan-yun2，HU Si-yuan1，WEIGuang-li2，XIA Yuan-yuan2
（1.ClinicalResearch InstituteOffice，The FirstAffiliated HospitalofTianjin University ofTraditionalChineseMedicine，Tianjin 300193，China；2.State Key Laboratory of Drug Delivery Technologyand Pharmacokinetics，Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 300301，China）

［Objective］App lication of DBSmethod in Reduning injection pharmacokinetics test，and comparison of plasma collection results of traditionalmethods.［M ethods］Theelbow vein blood taken from the volunteers，some blood was quantitativeanalysisby LCMS/MS quantitative analysis.We separated of the remaining blood plasma，analysis of blood drug concentration of geniposide and genipin，shanzhisidegentian diglucoside.Chromatographic column EcosilC18（150mm×4.6mm，5μm），themobilephasemethanol，20mM ammonium formate，0.1%formic acid，10%methanol，Velocity 0.5mL/min，sample size 10μL.Mass spectrometric detection using ESI ion source，the MRM positive ion detectionmode，acquisition time of 11 min.［Results］A single intravenous infusion of Reduning injection，the blood concentration of blood cell volume determination of three kinds of gardenia componentwith DBSafter correction，geniposide，shanzhiside，genipin gentian diglucoside in peak time（Tmax）were1.41，1.47，1.47 h.The peak concentration（Cmax）were4.580，0.285，0.550μg/mL.Thearea under the concentration time curve（AUC0-t）were9.060，0.638，1.200（μg·h）/mL.The average dwell time（MRT0-t）were 1.52，1.49，1.45 h.［Conclusion］It is consistent of blood drug concentration and pharmacokinetic parameters about the shanzhiside，genipin gentian diglucoside plasmamethod and DBSmethod（after correction）.It indicates thatDBSmethod can replace the traditional plasma processingmethod in pharmacokinetic studiesof drug stability ingredient.

DBS；Reduning injection；geniposide；pharmacokinetics；comparative study

R969.1

A

1672-1519（2015）02-0068-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.02

“十二五”重大新藥創制項目（2011ZX09302-006-03）。

倪天慶（1978-），男，副主任藥師，研究方向為中藥新藥的研究與評價。

胡思源，E-mail:HSY008@163.com。

（2014-10-23）