穴位局部TLR4在針刺后穴位局部炎癥反應中作用的初步研究*

席　強，崔　瑞，金　光，郭永明

·實驗研究·

穴位局部TLR4在針刺后穴位局部炎癥反應中作用的初步研究*

席強，崔瑞，金光，郭永明

（天津中醫藥大學實驗針灸研究中心，天津300193）

［目的］探討穴位局部TOLL樣受體4（TLR4）在針刺后穴位局部炎癥反應中的作用。［方法］將80只健康大鼠隨機分為針刺組和空白對照組，每組各40只。每組的40只大鼠再隨機分8個時點（即刻、15m in、30min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h），每個時點5只。采用ELISA法檢測各時間點穴區皮膚肌肉組織中TLR4、高遷移率族蛋白（HMGB1）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的濃度。［結果］空白對照組，各指標濃度在各時間點均無明顯變化；針刺組針刺后TLR4、HMGB1、IL-6、TNF-α濃度升高，而IL-1β濃度無明顯變化。對每只大鼠穴位局部TLR4與其他指標濃度的相關性進行分析發現，針刺后HMGB1、TNF-α與TLR4的相關性增強，IL-6與TLR4的相關性減弱，IL-1β與TLR4的相關性針刺前后則無明顯變化。［結論］穴位局部TLR4介導的通路可能是針刺后穴位局部炎癥反應產生的通路之一。

針刺；穴位；TOLL樣受體4；炎癥反應

針刺作為一種物理刺激，其在針刺穴位局部必然引起損傷［1］，由此引發的神經、內分泌、免疫互聯反應是針刺效應啟動的關鍵節點，因此圍繞針刺局部展開一些基礎研究對于揭示針刺作用規律及特點是至關重要的［2］。高遷移率族蛋白1（HMGB1）是一種重要的損傷相關模式（DAMP）分子，組織損傷時HMGB1可由壞死的細胞被動釋放和（或）激活的免疫細胞主動分泌至細胞外，作為內源性危險信號參與全身或局部的炎癥反應。TOLL樣受體4（TLR4）是跨膜信號傳導受體，在人類所有細胞中表達，不僅可識別外源性病原相關分子模式，還可識別DAMP，與其配體結合后介導的核轉錄因子（NF-κB）通路是機體內重要的炎癥反應通路之一。前期研究發現針刺引起的局部炎癥反應是針效產生的始動環節之一［3］。因此，本研究對針刺后穴位局部HMGB1、TLR4及相關炎性因子白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的濃度變化進行研究，以期為穴位局部TLR4可能參與針刺后穴位局部炎癥反應提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組選用SPF級健康成年Wistar大鼠80只，雌雄不拘，體質量（200±20）g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所動物實驗中心提供，許可證編號：SCXK-（軍）2009-003，實驗過程中對動物的處置符合相關動物倫理學要求。按隨機數字表將大鼠分為空白對照組和針刺組，每組按照干預后取材時間點的不同，隨機分為8個時點，分別為干預后即刻、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h組，每個時點5只。

1.2實驗材料酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（武漢華美生物科技有限公司），低溫低速離心機（美國，MICRROLTR）、全自動酶標儀（芬蘭，Thermo FisherMK-3）、針刺手法參數測定儀（上海，ATPⅡ型）。

1.3干預方法針刺組針刺大鼠右側足三里穴，深度約為7 mm（針灸針已固定進針深度），行提插平補平瀉法，頻率為每分鐘120次，行針2min。針刺手法于針刺手法參數測定儀上訓練，待手法操作波形示意圖持續穩定后方可行針刺干預，見圖1。空白對照組采用同針刺組完全相同的大鼠固定方法。

1.4標本制備分別取各組各個時間點穴周大小為0.8 cm×0.8 cm×0.6 cm的皮膚肌肉組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，放入-20℃的冰箱中保存，待樣本收集完后集中勻漿和離心。取100mg組織，用1×PBS洗去血污，剪成小塊放入組織研磨器（勻漿管）中，加入1mL 1×PBS，制成勻漿，然后置于-20℃過夜。經過反復凍融2次處理破壞細胞膜后，將組織勻漿于2～8℃5 000×g離心5min取上清。取適量上清液立即進行實驗，或將上清分裝保存于-20℃或-80℃，解凍后的樣品應再次離心，然后檢測。

1.5ELISA法檢測采用ELISA法對足三里穴區皮膚肌肉組織勻漿中的各指標含量進行檢測，嚴格按照說明書進行操作。

1.6統計學處理采用SPSS18.0統計軟件對實驗數據進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間同時間點的比較，若符合正態分布及方差齊，則采用兩獨立樣本t檢驗，若偏態分布或方差不齊則采用秩和檢驗，組內不同時點比較采用單因素方差分析，TLR4與其他各指標進行一元線性相關與回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1　針刺手法參數測定儀和每分鐘120次提插手法操作波形示意圖Fig.1　Acupuncture technique parameter tester and the wavesofshifting-thrustingacupuncturemanipulation with the frequency of 120 times perm inute

2　結果

2.1穴位局部各指標濃度隨時間的變化

2.1.1穴位局部HMGB1濃度隨時間的變化空白對照組組內各時間點均無統計學差異（P＞0.05），提示正常生理情況下，穴位局部的HMGB-1濃度比較穩定，固定對其無明顯影響；針刺組組內各時間點均無統計學差異，但針刺后8 h較其他各時間點有明顯升高趨勢；針刺后8 h較空白對照組8 h有統計學差異（P＜0.05），提示針刺可使穴位局部的HMGB1濃度發生變化，且在所觀察的時間段內于針刺后8 h達到高峰。見表1。

表1　不同時間點HMGB1濃度變化（±s）Tab.1　The changesof HMGB1 concentration atdifferent tim epoints（±s）ng/mL

表1　不同時間點HMGB1濃度變化（±s）Tab.1　The changesof HMGB1 concentration atdifferent tim epoints（±s）ng/mL

注：與空白對照組8 h比較，*P＜0.05。

分組即刻15min 30min 01 h 02 h 04 h 08 h 24 h n55555555空白對照組　　針刺組1 059.51±298.68　1 096.07±0 396.55 1 010.74±302.61　1 237.45±0 358.78 823.53±174.40　1 000.87±0 245.58 1 376.23±499.09　1 297.45±0 430.23 1 534.96±664.42　1 013.71±0 330.72 993.70±217.46　1 279.33±1 095.56 748.60±250.03　1 983.85±0 996.59* 1 017.43±370.45　1 101.99±0 535.99

2.1.2穴位局部TLR4濃度隨時間的變化空白對照組組內各時間點均無統計學差異（P＞0.05），提示正常生理情況下，穴位局部的TLR4濃度比較穩定，固定對其無明顯影響。針刺組組內各時間點均無統計學差異，但針刺后8 h較其他各時間點有明顯升高趨勢；針刺后8 h較空白對照組8 h有統計學差異（P＜0.05），提示針刺可使穴位局部的TLR4濃度發生變化，且在所觀察的時間段內于針刺后8 h達到高峰。見表2。

表2　不同時間點TLR 4濃度變化（±s）Tab.2　The changesof TLR4 concentration at different time points（±s）ng/m L

表2　不同時間點TLR 4濃度變化（±s）Tab.2　The changesof TLR4 concentration at different time points（±s）ng/m L

注：與空白對照組8 h相比，*P＜0.05。

分組即刻15min 30min 01 h 02 h 04 h 08 h 24 h n55555555空白對照組　　針刺組11.31±2.29　10.78±3.29 8.57±3.41　12.86±1.76 8.81±2.60　10.17±3.53 11.47±6.59　12.40±5.03 11.62±6.87　10.61±3.76 10.60±2.48　9.30±6.51 6.90±2.66　14.34±5.52* 9.37±4.72　10.29±5.66

2.1.3穴位局部IL-1β濃度隨時間的變化空白對照組組內各時間點之間均無統計學差異（P＞0.05），提示正常生理情況下，穴位局部的IL-1β濃度比較穩定，固定對其無明顯影響。針刺組組內各時間點之間均無統計學差異（P＞0.05）。兩組間對應時間點比較均無統計學差異（P＞0.05），提示針刺對穴位局部IL-1β濃度無明顯影響。見表3。

2.1.4穴位局部IL-6濃度隨時間的變化空白對照組組內各時間點之間均無統計學差異（P＞0.05），提示正常生理情況下，穴位局部的IL-6濃度比較穩定，固定對其無明顯影響；針刺組組內各時間點均無統計學差異，但針刺后15min、8 h較其他各時間點有升高趨勢；兩組各對應時間點比較均無統計學差異（P＜0.05），但針刺后15min、8 h較空白即刻、15min、30min、8 h、24 h有升高趨勢，提示針刺后穴位局部IL-6濃度可發生變化，且在所觀察的時間段內于針刺后15min、8 h達到高峰。見表4。

表3　不同時間點IL-1β濃度變化（±s）Tab.3　The changesof IL-1βconcentration at different tim e points（±s）ng/mL

表3　不同時間點IL-1β濃度變化（±s）Tab.3　The changesof IL-1βconcentration at different tim e points（±s）ng/mL

分組即刻15min 30min 01 h 02 h 04 h 08 h 24 h n55555555空白對照組　　針刺組255.29±98.94　254.78±58.10 299.04±171.38　430.68±147.07 195.61±35.09　277.75±123.23 508.33±368.59　498.75±336.01 538.50±536.58　292.51±110.65 250.73±93.38　328.92±393.55 265.15±203.20　284.54±72.53 292.56±191.49　306.79±223.08

表4　不同時間點IL－6濃度變化（±s）Tab.4　The changesof IL-6 concentration atdifferent tim e points（±s）ng/mL

表4　不同時間點IL－6濃度變化（±s）Tab.4　The changesof IL-6 concentration atdifferent tim e points（±s）ng/mL

分組即刻15min 30min 01 h 02 h 04 h 08 h 24 h n55555555空白對照組　　針刺組2.67±0.53　2.98±0.74 2.31±0.70　4.15±1.52 2.47±0.28　3.55±0.98 3.45±1.19　3.29±0.94 2.63±1.22　3.22±1.01 2.65±0.68　2.75±1.66 2.30±0.71　4.28±1.59 2.52±0.84　2.79±0.98

2.1.5穴位局部TNF-α濃度隨時間的變化空白對照組僅1 h組與15min組有統計學差異（P＜0.05），其余各時間點之間均無統計學差異，提示正常生理情況下，穴位局部的TNF-α濃度可維持在一定范圍內；針刺組組內各時間點之間均無統計學差異（P＞0.05）；但針刺后15min較空白對照組15min有統計學意義（P＜0.05），針刺后8 h較空白對照組8 h有升高趨勢（P＜0.05），提示針刺后穴位局部TNF-α濃度可發生變化，且在所觀察的時間段內，于針刺后15min、8 h達到高峰。見表5。

表5　不同時間點TNF-α濃度變化（±s）Tab.5　The changesof TNF-αconcentration atdifferent tim e points（±s）ng/m L

表5　不同時間點TNF-α濃度變化（±s）Tab.5　The changesof TNF-αconcentration atdifferent tim e points（±s）ng/m L

注：與空白15m in組相比，*P＜0.05。

分組即刻15min 30min 01 h 02 h 04 h 08 h 24 h n55555555空白對照組　　針刺組104.43±37.37　120.78±65.11 63.34±45.79　137.42±24.65* 92.46±46.26　93.12±36.82 124.48±54.20*　117.34±45.71 85.05±77.45　85.54±47.17 113.81±27.48　93.74±74.37 75.49±41.50　131.75±54.06* 93.18±51.68　94.12±61.47

2.2TLR4與各指標相關性分析

2.2.1TLR4與HMGB1相關性分析空白對照組和針刺組穴位局部HMGB1與TLR4的表達均呈正相關，而且針刺后穴位局部HMGB1與TLR4的相關性確定系數增大（回歸方程及相關系數，見圖2），說明針刺后穴位局部HMGB1的表達可能與TLR4關系密切。

圖2　空白對照組和針刺組HMGB1與TLR4濃度相關關系圖Fig.2　The concentration affinity d iagram betw een HMGB1 and TLR4 in controlgroup and acupuncturegroup

2.2.2TLR4與IL-1β相關性分析空白對照組和針刺組穴位局部IL-1β與TLR4的表達均呈正相關，針刺后穴位局部IL-1β與TLR4的相關性確定系數基本不變（回歸方程及相關系數，見圖3），提示針刺后穴位局部IL-1β的表達與TLR4關系不明顯。

圖3　空白對照組和針刺組IL-1β與TLR4濃度相關關系圖Fig.3　The concentration affinity diagram betw een IL-1β and TLR4 in controlgroup and acupuncturegroup

2.2.3TLR4與IL-6相關性分析空白對照組和針刺組穴位局部IL-6與TLR4的表達均呈正相關，針刺后穴位局部IL-6與TLR4的相關性確定系數減小（回歸方程及相關系數，見圖4），提示針刺后穴位局部IL-6的表達與TLR4之間缺乏直接聯系。

圖4　空白對照組和針刺組IL-6與TLR4濃度相關關系圖Fig.4　The concentration affinity diagram between IL-6 and TLR4 in controlgroup and acupuncturegroup

2.2.4TLR4與TNF-α相關性分析空白對照組和針刺組穴位局部TNF-α與TLR4的表達均呈正相關，而且針刺后穴位局部TNF-α與TLR4的相關性確定系數增大（回歸方程及相關系數，見圖5），說明針刺后穴位局部TNF-α的表達可能與TLR4關系密切。

圖5　空白對照組和針刺組TNF-α與TLR4濃度相關關系圖Fig.5　The concentration affinity diagram between TNF-α and TLR4 in controlgroup and acupuncturegroup

3　討論

前期研究發現［4］針刺后穴區肌肉組織可出現肌纖維斷裂，且斷裂的細纖維間隙有炎性細胞浸潤，為針刺后穴位局部可產生炎癥反應提供了形態學依據。此外，張迪等［5］研究發現針刺可促進肥大細胞脫顆粒，釋放組胺、緩激肽等物質，這些物質可擴張毛細血管及微靜脈，使血管內皮基底膜暴露，血管通透性增強，炎性介質滲出，為針刺后穴位局部可產生炎癥反應提供了病理學依據。調控穴位局部肥大細胞、相關活性物質對針刺效應有一定的影響，即調控炎癥反應的上游環節會影響到針刺效應。因此本研究圍繞TLR4的可能上游信號分子（HMGB1）及下游事件促炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表達展開，以初步明確TLR4在針刺引起局部炎癥反應中的作用。

HMGB1作為重要的晚期炎性因子（血液延遲表達6-32 h［6］），與TNF-α、IL-1β等早期炎性因子相互誘生，不斷放大炎性信號，造成炎癥失控遷延，在風濕關節炎、慢性肝病、惡性腫瘤、動脈粥樣硬化等疾病中發揮重要作用。但是新近的研究發現HMGB1還具有組織損傷因子作用，作為核蛋白，在多數組織細胞內含量豐富，而細胞一旦受損傷，膜結構受到破壞，細胞就會以單純擴散的方式釋放HMGB1，釋放進入細胞間隙的HMGB1可刺激樹突細胞的成熟、增殖，誘導免疫應答，使機體對已經發生的損傷產生防御反應和炎性反應。HMGB1還是致炎細胞因子調控網絡中的一個中心環節，不僅能促使TNF-α、IL-1β等表達，還能激活ERK激酶、P38MAPK激酶、JNK激酶并促使核轉錄因子（NF-κB）發生核移位［7］。因此，HMGB1在組織損傷后適當的時間釋放出來，可能參與炎癥過程中免疫和內分泌反應的調節［8］。針刺后穴位局部HMGB1的表達及升高可能啟動了穴位局部炎癥反應發生、發展和自我修復的過程，該過程可能與TLR4密切相關。

已經證實很多受體在HMGB1的信號轉導中起作用，包括晚期糖基化終產物受體（RAGE）和某些TOLL樣受體家族成員。研究發現TLR2和TLR4可與巨噬細胞、中性粒細胞分泌的HMGB1結合，促使NF-κB活化，誘導炎癥發生，提示TLR2和TLR4可能是HMGB1的潛在受體［9］。而且不同TOLL樣受體介導產生的炎性因子有所不同，孫立［10］觀察HMGB1誘導嚴重燒傷大鼠枯否細胞（KCs）促炎性細胞因子產生的分子機制，TLR4在HMGB1誘導KCs表達TNF-α的過程中起到更重要的作用，而HMGB1誘導KCs表達IL-1β主要依靠TLR2介導。TLR2和TLR4在燒傷后KCs中HMGB1信號轉導引起的細胞因子釋放過程中發揮著不同作用。本研究初步發現，TLR4在針刺誘導穴位局部TNF-α表達的過程中關系密切，而針刺誘導穴位局部IL-6的表達可能依賴別的途徑。

從穴位刺激到機體效應，兩者之間并不是直線性聯系，而是由體內復雜網絡調節系統介導的。現代研究也認為，生物體作為一個開放的復雜系統，是由無數個大小網絡相互聯系、整合而形成的［11］，針刺穴位局部就存在一個能將針刺物理信息轉化為生物信息的啟動網絡，HMGB1、TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α均是細胞因子網絡中的重要成員，具有廣泛的生物學活性，是機體神經-內分泌-免疫網絡調節的重要因子［12］。局部低濃度的IL-1β主要發揮免疫調節作用，它可直接產生于血管內皮細胞而在血管炎癥反應中發揮重要作用［13］。IL-6作為一種多效性因子是宿主對感染和組織損傷所引起反應的主要介質，同時也是參與炎癥反應，調節和增強免疫功能的重要細胞因子之一［14-16］。在炎癥反應中TNF-α作為重要的始發因子能作用于多種細胞，在細胞和亞細胞水平上激發一系列級聯反應，可以誘導IL-1β，IL-6，IL-8等細胞因子的瀑布樣釋放［17］，因此IL-1β、IL-6和TNF-α等除各自獨特的生物學作用外，還共同參與機體的免疫反應，并在其中互相補充、互相促進、互相制約［18］，在炎癥、應激反應中形成細胞因子網絡。本研究發現針刺后15min、8 h穴位局部IL-6、TNF-α濃度升高。針刺短時間內細胞因子濃度的升高可能是由于產生這些細胞因子的細胞在受針刺損傷刺激后，立即釋放出儲存在細胞內的mRNA，并迅速產生相應的細胞因子。8 h后IL-6、TNF-α濃度峰值可能與HMGB1、TLR4 8 h高表達相關，此外針刺后細胞因子的快速釋放在誘導和發動炎癥反應的同時，還會刺激穴區各種細胞，使之產生更多的細胞因子和其他化學遞質，形成各種因子協調工作網，共同完成針刺后炎癥的發生、發展和修復過程。

綜上所述，針刺后穴位局部產生的HMGB1可能作為穴位局部TLR4的內源性配體，兩者結合后通過激活TLR4介導的炎癥信號通路，使穴位局部產生以TNF-α表達為主的炎癥反應。穴位局部TLR4介導的炎癥信號通路可能是針刺后穴位局部炎癥反應產生的通路之一，但還有待進一步研究。

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（本文編輯：馬英，高杉）

Prelim inary research on the role of TLR4 at acupoints in the inflammatory reaction produced by acupuncture

XIQiang，CUIRui，JINGuang，GUOYong-ming
（ExperimentalResearch Center for Acupuncture in Tianjin University of TraditionalChineseMedicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate the role of TLR4 atacupoints in the inflammatory reaction produced by acupuncture.［Methods］The 80 health ratswere divided into acupuncture group and blank control group，each group 40 rats.Each group was random ly divided into8 time points（immediate，15min，30min，1 h，2 h，4 h，8 h，24 h），5 ratsper point.Testing the concentrationsofTLR4，HMGB1，IL-1β，IL-6，TNF-αin point area including skin and muscle tissue with ELISA.［Results］There were no significant changes in the concentration ofeach index ateach time point in controlgroup.Acupuncture could increase the concentrationsof TLR4，HMGB1，IL-6，TNF-α，whereas IL-1βconcentrations did not change.The concentrations of HMGB1，TNF-αhad certain relativity with the concentration of TLR4 respectively after acupuncture.However，the concentration of IL-6 had weaken relativity with TLR4and the concentration of IL-1βhad uncertain relativitywith TLR4.［Conclusion］TLR4 located atacupointsmay play an important part in the inflammatory reaction produced by acupuncture.

acupuncture；acupuncture point；TLR4；inflammatory reaction

R245.9

A

1672-1519（2015）02-0088-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.07

國家自然科學青年基金資助項目（81102641）。

席強（1984-），男，碩士，實驗師，研究方向為針刺作用始動機制。

郭永明，E-mail:guoymxr@163.com。

（2014-10-14）