生物可降解聚乙二醇-嵌段-聚乳酸的協同給藥研究*

胡祥龍，翟少東，張文佳，曹　冰，楊　軍

（1.華南師范大學激光生命科學研究所，激光生命科學教育部重點實驗室，生物光子學研究院，廣東廣州510631）

生物可降解聚乙二醇-嵌段-聚乳酸的協同給藥研究*

胡祥龍，翟少東，張文佳，曹冰，楊軍

（1.華南師范大學激光生命科學研究所，激光生命科學教育部重點實驗室，生物光子學研究院，廣東廣州510631）

腫瘤單一藥物治療的效果往往不佳，且易產生耐藥性，因此，腫瘤的多藥協同治療具有明顯優勢，并逐漸引起重視。本工作基于具有良好生物相容性和生物可降解性的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸（PEG-b-PLA）兩嵌段聚合物，物理包埋兩種化療藥物，阿霉素（Doxorubicin，DOX）和喜樹堿（Camptothecin，CPT），實現兩種化療藥物的共傳輸、藥物釋放與協同給藥，表現出良好的抗腫瘤活性。

聚乙二醇-嵌段-聚乳酸；生物可降解性；藥物釋放；協同給藥

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.04.009

0　引言

通過在傳統藥物系統中混合負載多種藥物實現復雜疾病的系統治療，相對于單一藥物治療，是一種方便，有效的手段［1，2］。近年來眾多載藥體系被用于多藥傳輸，如無機二氧化鈦納米管［3］、兩親性小分子膠束等［4］。其中，醫用高分子的載藥體系研究越來越引起關注，相對于無機材料，其具有良好的生物可降解性和生物相容性；相對于小分子表面活性劑，高分子載藥體系具有更好的穩定性、易功能化和良好的藥代動力學特征［5-9］。聚乳酸（PLA）和聚乙二醇（PEG）分別作為合成高分子的典型代表已被廣泛用作藥物載體，其安全性已經通過美國FDA認證。其中，PEG功能化PLA嵌段共聚物能夠有效地調控載體的親疏水性、藥物釋放速率和載藥率，延長藥物在血液中的循環時間、加強藥物靶向給藥能力［10］；其膠束內核可以同時負載多種疏水化療藥物，因此有望進一步用于多藥的共傳輸與協同給藥。

本工作中，我們采用聚乙二醇-嵌段-聚乳酸（PEG-b-PLA）為生物可降解載體，同時包埋兩種具有協同作用的抗腫瘤化療藥物阿霉素（DOX）和喜樹堿（CPT），可以很好地實現兩種協同化療藥物的共傳輸，表現出良好的協同抗腫瘤活性。

1　實驗部分

1.1試劑

聚乙二醇單甲醚（PEG45-OH，Mn=2.0 kDa，Mw/Mn=1.06），喜樹堿（camptothecin，CPT），阿霉素（doxorubicin hydrochloride，Dox·HCl）和辛酸亞錫等均采購自Sigma-Aldrich公司，直接使用。無水乙醚，四氫呋喃，二氯甲烷，甲苯等溶劑均購自國藥集團，甲苯使用前經干燥蒸餾處理。

1.2儀器與表征

核磁共振譜（NMR）采用Bruker AV300核磁共振儀表征（共振頻率為300 MHz，CDCl3為氘代試劑）。透射電子顯微鏡（TEM）測試在JEOL 2010電子顯微鏡完成，加速電壓120 kV，樣品制備時，吸取10 μL樣品溶液滴在Formvar薄膜和碳膜的銅網上，然后快速液氮冷卻，冷凍干燥以保持其在溶液態的形貌。水相中納米粒子的尺寸采用Malvern Nano ZS表征。紫外-可見光譜利用Unico UV/vis 2802PCS紫外可見分光光度計測試。

2　結果與討論

2.1生物可降解聚乙二醇-嵌段-聚乳酸PEG45-b-PLA30的合成

將單甲基聚乙二醇（2 g，1 mmoL）和丙交酯（7.21 g，50 mmoL）溶于50 mL干燥甲苯中，減壓除去大部分甲苯；在氮氣保護下，加入催化量辛酸亞錫；再減壓抽去部分甲苯，封閉體系，在100℃下反應12 h，用液氮終止反應，用四氫呋喃稀釋，無水乙醚沉淀，反復溶解、沉淀三次，經室溫干燥過夜，得到白色固體（7.8 g，產率為76.3%），其核磁共振氫譜表征如Fig.1所示，經過對比計算聚乙二醇主鏈中亞甲基質子在3.65 ppm處的積分面積與聚乳酸主鏈上的甲基質子在1.56 ppm處的積分面積，得到PLA的聚合度為30，其分子式表示為PEG45-b-PLA30。

2.2雙藥物負載的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸膠束納米粒子的制備與表征

由于PEG45-b-PLA30中聚乙二醇親水鏈的存在，因此其具有兩親性。本文采用“自下而上”的自組裝策略來制備負載雙藥物的PEG45-b-PLA30膠束納米粒子，先分別稱取5.0 mg PEG45-b-PLA30，1 mg喜樹堿，1 mg阿霉素溶解在1.0 mL DMSO中，再加入50 μL三乙胺使阿霉素鹽酸鹽去質子化，常溫攪拌溶解1 h；隨后將其快速注入達到快速攪拌的去離子水中，持續攪拌3 h，然后轉移到透析袋中對水透析，除去有機溶劑，多次換水，即可制備包埋兩種藥物的膠束納米粒子，進行濃度標定，并用于后續測試。

采用粒度儀對該載藥膠束在水相中的尺寸進行了表征，如Fig.2a所示，納米粒子的平均直徑約為53 nm，分布較窄，抗腫瘤藥物傳輸納米粒子的尺寸一般不超過200 nm會更加有利，因此，本體系中包埋兩種藥物的納米載體的尺寸滿足腫瘤治療的要求。如Fig.2b所示，采用透射電鏡（TEM）進一步表征了該載藥膠束系統干態下的尺寸與分布，直徑約為42 nm，略小于水相中的尺寸，這是由于在干態下的TEM測試中，外圍的PEG親水鏈是無法辨識的，造成粒徑略小的現象。另外，基于標準曲線法，測定了該載藥膠束系統對阿霉素和喜樹堿的載藥量分別達到8. 2%和10.6%。

圖1　生物可降解聚乙二醇-嵌段-聚乳酸PEG45-b-PLA30分子結構及其核磁共振氫譜表征Fig.1　Chemical structure and 1H NMR spectrum of PEG45-b-PLA30diblock copolymer

圖2　聚乙二醇-嵌段-聚乳酸PEG45-b-PLA30負載阿霉素和喜樹堿藥物的膠束表征：（a）流體力學尺寸（DLS）分析；（b）透射電鏡（TEM）表征Fig.2　（a）Hydrodynamic diameter distributions，＜Dh＞，and（b）TEM image recorded for CPT and DOX co-loaded polymeric micelles fabricated from PEG45-b-PLA30diblock copolymer

圖3　包埋阿霉素和喜樹堿的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸雙藥物系統的體外藥物釋放曲線Fig.3　DOX and CPT release profiles recorded for CPT and DOX co-loaded polymeric micelles fabricated from PEG45-b-PLA30upon incubation with PBS buffer at pH 7.4

2.3藥物釋放評價

取200 μL 0.1 g/L的載藥膠束裝入透析管中，然后將該透析管浸入磷酸鹽（PBS）緩沖液中，設定條件為pH 7.4，溫度37℃，定時取10 mL透析液測試，并補充等體積的新鮮緩沖液到試劑瓶中。采用紫外分光光度計定量藥物釋放的速率。如Fig.3所示，得到阿霉素和喜樹堿的體外藥物釋放曲線，在生理條件下孵育24 h，阿霉素和喜樹堿的累計釋放量分別達到43%和36%，因此，被包埋在膠束疏水內核的兩種化療藥物均可以釋放出來，而且具有良好的可控性特征。

2.4抗腫瘤活性評價

本工作中，我們選用HepG2細胞系，利用MTT法評價了該載藥膠束的抗腫瘤活性。首先將HepG2細胞接種到96孔板上，每個孔添加100 μL培養基，初始密度約為每孔80 000個細胞，培養過夜至細胞貼壁，再用換取新鮮的培養基替代，分別加入空白膠束、小分子抗癌藥物阿霉素、喜樹堿或載藥的膠束，共培養48 h。另設細胞空白對照組和培養基空白組，每孔設5復孔。每孔加入20 μL MTT試劑（PBS溶液，5 mg/mL-1），繼續培養5 h后，吸出DMEM培養基，加入180 μL DMSO，酶標儀檢測570 nm的吸光度值（A）。每次實驗條件均采集四組數據，所得到的最終數據是四組平行試驗的平均值及標準偏差（±SD），以培養基空白組調零，計算細胞存活率。如Fig.4a所示，PEG45-b-PLA30空白膠束具有很好的生物相容性，聚合物濃度達到300 μg/mL的情況下，其存活率仍然高于80%；另外，已有報道表明阿霉素和喜樹堿對多種腫瘤具有較好的協同抑殺作用［11，12］，本文也研究了負載有兩種藥物膠束的細胞毒性并與小分子抗癌藥物對比，如Fig.4a所示，負載有兩種藥物的膠束系統比單一小分子抗癌藥物具有更高的抗腫瘤活性，從而說明本體系中的協同給藥功能具有明顯的優勢，表現出良好的抗腫瘤活性。

3　結論

近年來，多藥傳輸被用于抗腫瘤研究越來越受到關注，且基于生物可降解高分子的多藥協同傳輸體系更具有優勢。本文利用具有良好生物相容性和生物可降解性的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸作為載體，同時物理負載兩種化療藥物，阿霉素和喜樹堿，制備了分布較均勻的球形納米粒子。細胞生物學評價表明，該雙載藥膠束系統對HepG2細胞實現了協同給藥，具有較好的抑殺效果。本文研究表明，生物可降解高分子聚乙二醇-嵌段-聚乳酸在腫瘤的多藥協同傳輸、協同給藥領域具有良好的應用前景。

圖4　（a）聚乙二醇-嵌段-聚乳酸PEG45-b-PLA30的空白膠束溶液與HepG2細胞共培養48 h的細胞活性；（b）包埋阿霉素和喜樹堿的聚乙二醇-嵌段-聚乳酸膠束溶液與HepG2細胞共培養48 h的細胞毒性評價Fig.4　Cell viability determined by MTT assay for HepG2 cells upon incubation 48 h with aqueous dispersion of（a）blank micelles of PEG45-b-PLA30diblock copolymer，and（b）CPT and DOX co-loaded polymeric micelles of PEG45-b-PLA30at varying equivalent drug concentrations

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Synergetic Drug Treatment Based on Biodegradable Poly（ethylene glycol）-b-Poly（lactic acid）Nanocarriers

HU Xianglong，ZHAI Shaodong，ZHANG Wenjia，CAO Bing，YANG Jun
（1.MOE Key Laboratory Laser Life Science&Institute of Laser Life Science，College of Biophotonics，South China Normal University，Guangzhou 510631，Guangdong，China）

The therapeutic efficiency of tumors upon treating with single drug is usually unsatisfactory，which would probably result in drug resistance.Hence，the multi-drug synergetic therapy against tumors has exhibited some advantages and attracted attention gradually.In the current work，biocompatible and biodegradable poly（ethylene glycol）-b-poly（lactic acid），（PEG-b-PLA），was employed to encapsulate two types of anticancer drug，doxorubicin（DOX）and camptothecin（CPT）.It was demonstrated that dual drug delivery，release，and synergetic drug treatment was realized in the nanocarrier，exhibiting good anticancer activity.

poly（ethylene glycol）-b-Poly（lactic acid）；biodegradability；drug release；synergetic drug treatment

Q225

A

1007-7146（2015）04-0354-04

2015-05-26；

2015-06-12

國家自然科學基金項目（51403042）；廣東省自然科學基金項目（2014A030310310）

胡祥龍（1984-），男，漢族，安徽六安人，華南師范大學講師，博士，主要從事生物醫用高分子研究。（電話）020-85211436；（電子郵箱）xlhu@scnu.edu.cn