普陀海域鲹科的DNA條形碼研究

許澤灘，王紅萍，顧寒梅，陳永久

（浙江海洋學院海洋科學與技術學院，浙江舟山　316022）

研究簡報

普陀海域鲹科的DNA條形碼研究

許澤灘，王紅萍，顧寒梅，陳永久

（浙江海洋學院海洋科學與技術學院，浙江舟山316022）

舟山普陀海域的漁業資源豐富，為魚類多樣性研究提供了獨特的優勢。鲹是經濟價值很高的海洋魚類，普遍分布于熱帶，亞熱帶和溫帶海域，常棲息于普陀沿海海域。本文采用線粒體COI DNA序列，對來自普陀海域18尾鲹的樣本進行分子條形碼和物種多樣性分析。結果顯示，共有12個單倍型，分別隸屬于7屬8種，其中3種在該海域首次紀錄。此外，結合GenBank的序列數據，共獲得12屬18種鲹的COI DNA同源序列，并構建了NJ與Bayesian聚類樹。通過聚類關系，各物種的進化關系及其分類地位可以直觀地顯示出來。DNA條形碼彌補了傳統分類學在鲹科魚的命名及分類歸屬上的不足，從而增進人們對鲹科魚在舟山普陀海域物種多樣性的了解，為當地養殖業及海洋保護提供科學理論框架。

普陀海域；鲹；DNA條形碼；物種多樣性

東海是西太平洋北部一個陸緣海，由于常年受到江河入海徑流與暖流等的共同影響，為魚類生存提供優良的自然環境條件，成為了我國重要的天然漁場［1-2］。東海的海洋漁業資源豐富，產量高，捕撈總量達到全國近50%［3］。在東海區，舟山漁場曾是我國漁業資源最為豐富，生產力水平最高的漁場之一［4］。地處舟山群島東南部的普陀海域擁有大小島嶼455個，海域面積6 269.4 km2［5］，獨特的地理環境為魚類多樣性的研究提供了優越的條件。

鲹科Carangidae隸屬硬骨魚綱Osteichthyes、鱸形目Perciformes，廣泛分布于全球熱帶，亞熱帶及溫帶沿海海域。曾經根據其側線上是否有棱鱗以及臀鰭基底與第二背鰭基底的長度比較分為鲹亞科Caranginae、鯧鲹亞科Trachinotinae、鰤亞科Seriolinae這三個亞科［1］，而目前被普遍認可的是在已有的基礎上增加鰆鲹亞科Chorineminae［6］。在舟山群島近海，包括東南部普陀海域記載的鲹科魚類有11屬17種（表1），其中藍圓鲹Decapterus maruadsi、日本竹莢魚Trachurus japonicus等［7］為該海域的主要經濟魚類。

自從TAUTZ等［8］首次提出DNA分類學的觀點后，由HEBER等在其基礎上首次真正提出DNA條形碼［9］。DNA條形碼通過目的基因DNA序列的差異來鑒定物種的新方法。這種方法能很好的彌補傳統分類學上沒有統一分類標準的缺陷，為新種的鑒定、隱存種及潛在的遺傳多樣性的挖掘提供有力的新的技術保障。同時可以糾正傳統分類學中存在的分類錯誤。譬如傳統分類學中認為梅童魚屬中存在著黑鰓梅童魚Collichthys niveatus和棘頭梅童魚Collichthys lucidus兩個物種，但是通過COI序列分析得出它們的遺傳距離僅為0.004，推斷二者遺傳變異尚未達到種的分化水平［10］。

DNA條形碼在鲹科種類鑒定和多樣性分析中的應用較為廣泛，JAAFAR等［11］應用DNA條形碼挖掘出潛在物種，進而豐富物種多樣性；HAQ等［12］通過DNA條形碼，對觀賞類金鯧魚進行種內鑒定。本項研究嘗試通過比較鲹科魚線粒體COI DNA序列的種內和種間差異，以期建立普陀海域鲹科魚類的DNA條形碼，以及闡述物種多樣性情況，同時可以驗證COI DNA序列在鲹科魚分子條形碼分類中的適用性。此外，還可確立鲹科魚類的分類地位及其分子系統進化關系。

1　材料與方法

1.1樣本采集與保存

于2011年7月至2013年8月之間，在舟山群島東南部普陀各島嶼（六橫島、桃花島、登步島、朱家尖以及舟山本島）的沿岸海域采集了18個鯵樣本。取胸鰭保存于95%乙醇中，于-20℃冰箱中保存。根據采集地不同，樣本分別標記為：舟山本島沈家門（簡稱SJM）、朱家尖（簡稱ZJJ）、登步島（簡稱DB）、桃花島（簡稱TH）、六橫島（簡稱LH）。圖1顯示采樣地點的地理信息。

圖1　地圖顯示鲹科魚樣本的采集地點Fig.1　Map shows sampling locations for Carangidae in the Putuo sea

1.2DNA提取、擴增及測序

圖2　基于鲹科魚類的線粒體COⅠ基因單倍型序列獲得的Bayesian系統樹Fig.2　Bayesian phylogeny of Carangidae based on COI DNA sequences

1.3數據分析

采用BioEdit v.7.0.9.0［14］編輯所得樣本的DNA片段序列，再用ClustalX 2.0［15］將編輯好的DNA序列進行比對，并輔以人工校對。通過BLAST工具，將所得DNA序列在GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/blast.cgi）及BOLD［16］中進行相似性檢索，得出物種名稱。使用DnaSP 5.0［17］軟件檢測多態位點、突變位點及單倍型數等信息。使用MAGA 5.0［18］軟件檢測不同序列的堿基含量，以及計算種間及種內Kimura-2-parameter（K-2-P）遺傳距離。聚類分析采用MAGA 5.0軟件中的鄰接法（neighbour-joining，NJ）和MrBayes v.3.1［19］軟件中的貝葉斯法（Bayesian）。聚類樹各分支上的置信度值為10 000次重復抽樣檢驗；貝葉斯法采用兩個同步搜索，每次由4個MCMC（Markov Chain Monte Carlo）鏈和1 000萬重復的間隔為1 000的采樣組成。最初的2 500個樹丟棄，鏈間分裂頻率的平均標準差用來推斷MCMC運行的完善程度。最佳核苷酸替換模型由jModeltest v.0.1.1［20］計算得出。

2　結果

從普陀近海海域獲取到的18尾鲹樣本中，經過測序和BioEdit v.7.0.9.0編輯后，獲得長度為615 bp 的CO1 DNA片段序列。在BOLD中查詢的結果顯示，這18尾鲹科魚分別歸屬于8個物種，7個屬共檢測到11條單倍型（表1），單倍型多樣性指數為0.915 0（Hd），核苷酸多樣性指數為（Pi）0.126 89，變異位點為182，約占29.6%。COI序列中T、C、A、G的含量分別為30.4%、27.4%、24.6%、17.6%。A+T的含量（55.0%）明顯高于C+G的含量（45.0%）。K-2-P計算的遺傳距離顯示，鲹科魚種內的距離值為0.000～0.003，平均為0.000 8；其中，六帶鲹的平均種內遺傳距離為0.002 1，卵形鯧鲹的平均種內遺傳距離為0.000 5，少耙若鲹的平均種內遺傳距離為0.001 6。屬內種間距離值為0～0.15，平均為0.042 5?？茖匍g距離值為0.020～0.23，平均為0.164（表2）。從表2可以看出，屬內種間距離明顯大于種內距離（約51倍），科內屬間的距離都大于屬內種間的距離。

根據趙盛龍和鐘俊生［7］的新考所列的這個海區鲹科魚種類，另外18條鲹科魚的序列從GenBank中下載，獲得36條長度為602 bp的COI DNA序列。這36條DNA序列共定義了26個單倍型。BOLD建議DB2與Trachurus japonicus Temminck et Schlegel，1842（竹莢魚）合并為1個單倍型；TH4和TH7與Caranx sexfasciatus Quoy&Gaimard，1825（六帶鲹）共享1個單倍型；TH5、TH6、TH9、ZJJ1、ZJJ2與Trachinotus ovatus（Lacepede，1801）（卵形鯧鲹）共享1個單倍型；LH2與Alectis ciliaris（Bloch，1788）（短吻絲鲹）共享1個單倍型；SJM與Alepes kleinii（Bloch，1793）（麗葉鲹）共享1個單倍型；LH1、DB1與Carangoides hedlandensis Whitley，1934（少耙若鲹）共享1個單倍型；LH3與Decapterus akaadsi Abe，1958（紅尾圓鲹）共享1個單倍型。

貝葉斯法系統關系分析采用jModeltest軟件建議的最佳核苷酸替換模型HKY+G+I。以青石斑魚Epinephelus awoara（Temminck&Schlegel，1842）（Genbank登錄號為NC_018773）為外群，獲得的鲹科NJ聚類樹和Bayesian系統樹的拓撲結構基本一致（貝葉斯樹如圖2）。兩個樹一致顯示，紅尾圓鲹與藍圓鲹（遺傳距離為0.022）聚成一支，為姐妹種；黑紋條鰤和黃尾鰤合成一支；麗葉鲹與及達副葉鲹合為一屬。

3　討論

本研究建立了采自舟山普陀海域的鲹科魚類的線粒體COI DNA條形碼。DNA序列分析表明，鲹科魚屬內種間距離明顯大于種內距離。所建立的DNA條形碼符合HEBERT等提出DNA條形碼的要求：種內距離小于0.01，屬內種間的遺傳距離必須顯著大于種內的遺傳距離，而且種間距離與種內距離的比值必須達到10倍以上。另外，屬內種間的遺傳距離和科內屬間的遺傳距離存在重疊部分，這種現象先前張俊斌等［21］已有報道。JAAFAR等［11］為生活在印度馬來群島海域的36種鲹科魚進行其線粒體的COI序列檢測，結果發現，在鲹科魚的不同分類階層中，K-2-P距離存在一定的重疊：種內距離：0～0.048 2；屬內種間距離：0～0.164 0；科內距離：0.086 4～0.253 9，與本次實驗獲得的數據較為相近（種內距離0～0.003；屬內種間距離：0～0.15；科內距離：0.022～0.23）。HAQ等［12］對金鯧魚Trachinotus blochi Lacepede，1801的鑒定過程中發現，其長度為637-655 bp的DNA序列中，T的含量表現為最高（約30%），而G的含量則為最低（約18%），其（A+T）的含量始終高于（G+C）的含量。本實驗中的18尾鲹科魚的長度為627 bp的CO1序列中同樣得到相似的結論：T、C、A、G的含量分別為30.4%、27.4%、24.6%、17.6%。A+T的含量（55.0%）明顯高于C+G的含量（45.0%）。

DNA條形碼結果建議，普陀海域的18尾鲹分別歸屬于7屬8種。從獲得的聚類樹上可以看出，這些鲹形成3個分支，可作為獨立的單系群，依次為：鰤亞科、鯧鲹亞科、鲹亞科，這種聚類關系與形態分類相吻合。目前中國對于麗葉鲹與及達副葉鲹的屬種定名較為混亂，一定程度上說明了分類系統僅僅依賴傳統形態學有一定的缺陷。朱元鼎等［1］在東海魚類志中，將麗葉鲹Caranx（Atule）kalla（Cuvier et Valenciennes，1833）與及達葉鲹Caranx（Atule）djeddaba（Forskal，1775）（即及達副葉鲹）歸為一屬——葉鲹屬，這種觀點與成慶泰等［22］編制的《中國魚類系統檢索》一致，而劉瑞玉等［23］編制的《中國海洋生物名錄》中，將麗葉鲹Atule kalla Cuvier，1833歸于葉鲹屬，將達副葉鲹Alepes djedaba（Forssk?l，1775）歸于副葉鲹屬。以上的分類均以形態學為基礎，而魚類在不同生長周期內會有一定程度的形態變化，包括體型和眼睛等；變化原因可能是環境變化導致魚類在外在形態上發生較為明顯的變化［24］，但是其遺傳物質尚未發展到可以將兩者區分與形態上那樣明顯，從而出現分類不明確的現象。圖2中可見，麗葉鲹與及達副葉鲹以極高的支持率聚在一起（Posterior probability支持率為99），兩者K-2-P的距離為0.078，屬于種間距離，這與朱世華等［25］得出的結論相同，也用數據驗證了WoRMS中將麗葉鲹的學名更為Alepes kleinii（Bloch，1793）與及達副葉鲹的學名更為Alepes djedaba（Forssk?l，1775）的合理性。

趙盛龍和鐘俊生［7］提出，整個舟山海域有鲹科魚17種，隸屬于11屬，其中5個物種僅出現在文獻，未獲得其樣本（高體若鲹、六帶鲹、及達副葉鲹、紅鰭圓鲹、頜圓鲹）。根據BOLD建議和聚類關系，本次研究在普陀海域共發現8種鲹，其中5個物種已被舟山海域魚類名錄新考記載，另外3種鲹，紅尾圓鲹（無斑圓鲹）Decapterus kurroides akaadsi Cuvier，1833、少耙若鲹Carangoides hedlandensis Whitley，1934、小斑鯧鲹Trachinotus baillonii Lacepede，1802沒有出現在2005年的舟山群島魚類調查報告中［7］，因此我們建議把這3種列為舟山群島近海海域的新記錄種。

致謝：感謝顧翠平、嚴安琪、Jamel Tyso James在采樣和分析過程中提供幫助。

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DNA Barcoding Carangids in Putuo Sea

XU Ze-tan，WANG Hong-ping，GU Han-mei，et al
（Marine Science and Technology School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022，China）

Putuo Sea is rich in fishery resources and provides unique advantages for studying the fish diversity.Carangids are commercially important marine species that are widely distributed across tropical，subtropical and temperate waters，including Putuo Coastal Sea.In this study，we used mitochondrial COI DNA sequences to analyze 18 carangids from offshore of Putuo islands.Results revealed a total of 12 haplotypes that belong to 8 species of 7 genera，and three of them is recorded in the first time in the area.With additional homologous sequence data from GenBank，NJ and Bayesian trees showed 18 species of 12 genera.The trees allow us to visually evaluate the phylogenetic relationships and taxonomic status of the species.DNA barcoding complements the deficiencies in traditional taxonomy and classification of carangids，and improve our understanding of the species diversity in Zhoushan waters；Therefore，it provides scientific theoretical framework for the local mariculture and marine conservation.

Putuo sea；Carangidae；DNA barcodes；species diversity

表1　普陀海域鲹科樣本和GenBank下載的鲹科COⅠDNA 序列信息（采樣地的編號見圖1）Tab.1　CO I DNA sequence information of Carangidae for samples collected from Putuo Sea and downloaded from GenBank （See codes of sampling locality on Fig.1）

表2　基于COI 基因片段序列變異的鲹科魚種內、種間及屬間的K-2-P 遺傳距離Tab.2　Intraspecific and interspecific K-2-P genetic distances among samples of Carangidae based on CO I DNA sequences

Q959.483

A

1008-830X（2015）02-0105-07

2014-08-24

浙江海洋學院留學回國人員啟動基金；浙江省舟山市博士（后）聯誼會重點項目基金；浙江省臨海市社科聯基金（13YB01）

許則灘（1991-），男，浙江蒼南人，碩士研究生，研究方向：海洋生物學.E-mail:xuzetan@163.com

陳永久.E-mail:yongjiuchen@hotmail.com