荷葉中化學成分的分離與鑒定（Ⅲ）*

夏明輝，彭　雙，趙　晶，韓立峰，張　祎，王　濤

·中藥研究·

荷葉中化學成分的分離與鑒定（Ⅲ）*

夏明輝1，彭雙2，趙晶1，韓立峰1，張祎1，王濤1

（1.天津市中藥化學與分析重點實驗室，天津300193；2.青海省青海湖藥業有限公司，西寧810000）

［目的］研究荷葉中的化學成分，為進一步開發利用荷葉資源提供依據。［方法］采用正相硅膠、反相ODS、SephadexLH-20等柱色譜及制備型高效液相色譜法（HPLC）等方法進行分離純化，并通過理化性質、質譜、核磁以及文獻比對等方法，對化合物的結構進行鑒定。［結果］從荷葉體積分數為70%的乙醇提取物中分離鑒定了6個化合物，分別為：sarmentol F（1）；（3S，5R，6S，7E，9R）－7－megastigmene－3，6，9－triol（2）；（3S，5R，6R，7E）－3，5，6－trihydroxy－7－megastigmen－9－one（3）；3S，5R－dihydroxy－6R，7－mestigmadien－9－one（4）；3S，5R－dihydroxy－6S，7－mestigmadien－9－one（5）；R－（－）－去氫催吐蘿芙葉醇（6）。［結論］化合物1～6均為首次從蓮屬植物中分離得到。

荷葉；化學成分；結構鑒定

荷葉（Nelumbinis Folium）為睡蓮科蓮屬植物蓮（NelumbonuciferaGaertn.）的干燥葉。其具有清暑化濕、升發清陽、涼血止血之功效［1］。現代藥理研究表明，荷葉具有調脂降脂［2-4］、抗氧化［5］、抗衰老［5］及抑菌［6］等作用。荷葉中主要含有生物堿［7］、黃酮、降倍半萜、木脂素等化學成分，筆者對其化學成分進行了系統研究［8-9］，本文繼續報道從該屬植物中首次分離得到了6個化合物。它們分別為：sarmentol F（1）；（3S，5R，6S，7E，9R）－7－megastigmene－3，6，9－triol（2）；（3S，5R，6R，7E）－3，5，6－trihydroxy－7－megastigmen－9－one（3）；3S，5R－dihydroxy－6R，7－mestigmadien－9－one（4）；3S，5R－dihydroxy－6S，7－mestigmadien－9－one（5），以及R－（－）－去氫催吐蘿芙葉醇（6）。

1　儀器與材料

Agilent 6520系列Q-TOF質譜儀（美國Agilent公司），安捷倫1200制備型高效液相色譜儀（G1361A prep pump，G1365D 1260 MWD，美國Agilent公司），安捷倫1200分析型高效液相色譜儀（G1314A VWD串聯Alltech 3300 ELSD，溫度：45℃；氣流量：1.5 L/min；gain：4；美國Agilent公司），HPLC用分析型色譜柱及制備型色譜柱：安捷倫zorbax C18色譜柱、安捷倫Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm× 21.2 mm，7 μm及 250 mm×4.6 mm，5 μm），Bruker 500 MHz超導核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）。

柱色譜硅膠（200～300目，青島海洋化工廠）；ODS（50 μm，日本YMC公司）；Sephadex LH-20（美國GE公司）；薄層色譜硅膠預制板GF254（青島海洋化工廠）；展開劑：氯仿-甲醇-水（下層，系列體積比例）；薄層顯色劑：10%的硫酸乙醇溶液（V/V）；甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚等（分析純或色譜純，天津市康科德科技有限公司）、二氯甲烷，氨水（分析純，天津市北方天醫化學試劑廠）、冰乙酸（分析純，天津市化學試劑三廠）。

所用藥材荷葉（Folium Nelumbinis）購自河北安國藥材市場，經天津中醫藥大學張麗娟教授鑒定為睡蓮科植物蓮（Nelumbo mucifera Gaertn.）的干燥葉。植物標本現保存于中醫藥研究院。

2　提取與分離

取干燥荷葉藥材20 kg，用70%的乙醇水溶液（V/V）加熱回流提取兩次，合并濾液，減壓濃縮回收有機溶劑后，50℃真空干燥，得浸膏約2 394 g，取其中2 280 g，用適量水懸浮后，用4種有機溶劑萃取，分別得石油醚層32 g，二氯甲烷層137 g，乙酸乙酯層77 g和正丁醇層364 g。取二氯甲烷部分（100 g）經硅膠柱層析 ［先用石油醚-乙酸乙酯-氨水10∶1∶0→3∶1∶0→1∶1∶0.002→1∶5∶0.006→1∶10∶0.011（V/V/V）為流動相進行梯度洗脫，然后再用乙酸乙酯、甲醇進行洗脫］，合并得到12組流分（Fr．1－12）。取其中Fr．7（6．0 g），經ODS柱色譜，MeOH－H2O體積比30∶70→40∶60→50∶50→60∶40→100∶0梯度洗脫，合并得到15組流分（Fr．7．1－15）。其中Fr．7．2（277 mg）、Fr．7．7（96．8 mg）經Sephadex LH－20以及制備型高效液相色譜法（HPLC）等手段分離，分別得到化合物6（58mg）和化合物1（13mg）。取Fr．9（5．2 g），經ODS柱色譜，MeOH－H2O體積比30∶70→40∶60→50∶50→60∶40→100∶0梯度洗脫，合并得到14組流分（Fr．9．1－14）。其中Fr．9．3（289 mg）、Fr．9．4（249 mg）、Fr．9．5（448 mg）經Sephadex LH－20及制備HPLC等手段分離，分別得到化合物3（12mg）、化合物4（14mg）、化合物2（31mg）、化合物5（15mg）?；衔?～6結構見圖1。

3結構鑒定

化合物1：棕色油狀物。TLC板上，10%的硫酸乙醇溶液（V/V）顯色呈棕色。HR-MS給出其準分子離子峰m/z 211.136 8［M-H］-，得出分子式為C13H24O2（Calc.C13H23O2，211.170 4）。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）譜的低場區有2組dd峰：δ 5.29（1H，dd，J= 15.5，9.5 Hz，H-7）和5.50（1H，dd，J=15.5，6.5 Hz，H-8），為反式烯氫質子信號；在高場區可觀察到四組甲基峰，其中有2個單峰：δ 0.84（3H，s，H-11）和0.88（3H，s，H-12），1個dd峰：δ 1.27（3H，dd.J=6.5，1.5 Hz，H-10），1個d峰：δ 0.82（3H，d，J=7.0 Hz，H-13）；此外，高場區及中低場區還有幾組多重峰：δ 1.74（1H，ddd，J=13.0，4.0，2.0 Hz，H-2a）、1.12（1H，m，H-2b）、3.79（1H，m，H-3）、2.10（1H，ddd，J=12.0，6.0，4.0 Hz，H-4a）、0.93（1H，m，H-4b）、1.53（1H，m，H-5）、1.31（1H，m，H-6）、4.30（1H，m，H-9）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）譜中顯示有13個碳信號，結合DEPT譜可知化合物1包括1個季碳，2個仲碳，6個叔碳，4個甲基。在低場區只有2個碳信號：δ 130.6和137.3，即為反式雙鍵上的碳信號。中高場區的2個叔碳信號δ 69.0和66.9，從化學位移值可知各連有一個羥基。結合HSQC，知低場區的δ 31.3、23.7、21.4、21.1為4個甲基碳信號。核磁數據（見表1）與參考文獻［10］對照后，數據基本一致，確定化合物1為sarmentolF。

化合物2：無定形粉末。TLC板上，體積分數為10%的硫酸乙醇溶液（V/V）顯色呈棕色。HR-MS給出其準分子離子峰m/z 251.163 5［M+Na］+，得出分子式為C13H24O3（Calc.C13H24O3Na，251.161 8）。1H-HMR（500 MHz，CD3OD）譜的低場區有2組特征信號：δ 5.72（1H，dd，J=16.0，6.0 Hz，H-8）和5.55（1H，d，J= 16.0 Hz，H-7），知該化合物中有一個反式雙鍵；在高場區可明顯觀察到4組甲基峰：δ 1.24（3H，d，J=6.5 Hz，H-10）、0.89（3H，s，H-11）、0.98（3H，s，H-12）、0.81（3H，d，J=7.0 Hz，H-13）及幾組多重峰：δ 1.93（1H，m，H-5）、1.67（1H，m，H-2a）、1.38（1H，m，H-2b）、1.66（1H，m，H-4a）、1.40（1H，m，H-4b）；在中高場區也有2組明顯的多重峰：δ 3.80（1H，m，H-3）和4.29（1H，m，H-9）。13C-NMR（125 MHz，CD3OD）譜中顯示有13個碳信號，結合HSQC譜可知該化合物有2個仲碳，5個叔碳、2個季碳和4個甲基。其中δ 135.5（C-8）和133.9（C-7）為反式雙鍵的2個碳信號；而δ 25.9（C-11）、25.2（C-12）、24.2（C-10）和16.5（C-13）則為4個甲基碳信號。核磁數據與參考文獻［11］相對照，基本一致（見表1），確定化合物2為（3S，5R，6S，7E，9R）-7-megastigmene-3，6，9-triol。

圖1　化合物1～6的結構

化合物3：無色油狀物。TLC板上，紫外燈（254nm）下有一暗斑，10%的硫酸乙醇溶液（V/V）顯色呈桔紅色。HR-MS給出其準分子離子峰m/z 277.121 3［M+ Cl］-，確定其分子式為 C13H22O4（Calc.C13H22O4Cl，277.121 2）。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）譜的低場區有2組特征信號：δ 7.29（1H，d，J=16.0 Hz，H-7）和6.37（1H，d，J=16.0Hz，H-8），知為反式雙鍵上的質子信號；在高場區可觀察到4組甲基單峰：δ 2.32（3H，s，H-10）、1.28（3H，s，H-11）、0.87（3H，s，H-12）、1.17（3H，s，H-13）；此外，還有幾組多重峰：δ 4.18（1H，m，H-3）、1.61（1H，m，H-2）、1.88（1H，ddd，J=13.0，5.0，1.5 Hz，H-4a）、1.78（1H，dd，J=13.0，11.5 Hz，H-4b）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）譜中顯示12個碳信號，從HMBC譜中知，有一個碳信號與溶劑峰重疊。結合DEPT譜可知該化合物有4個季碳，2個仲碳，3個叔碳和4個甲基。最低場區的δ 198.0（C-9）為α，β-酮羰基信號；δ 148.7（C-7）和131.2（C-8）為反式雙鍵的2個碳信號：而δ 26.6（C-10）、25.6（C-11）、27.7（C-12）和27.5（C-13）為4個甲基碳信號。上述核磁數據與參考文獻［12］相對照，基本一致（見表1），確定化合物3為（3S，5R，6R，7E）－3，5，6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one。

化合物4：無色油狀物。TLC板上，紫外燈（254nm）下有一暗斑，10%的硫酸乙醇溶液（v/v）顯色呈棕色。HR-MS給出其準分子離子峰m/z 247.130 7［M+Na］+，推測其分子式為C13H20O3（Calc.C13H20O3Na，247.1305）。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）譜的低場區有1個明顯的單峰：δ 5.85（1H，s，H-8）；中高場區有1個多重峰，根據峰面積知為1個次甲基質子信號：4.34（1H，m，H-3）；在高場區有4組明顯的單峰，均為甲基峰：2.18（3H，s，H-10）、1.43（3H，s，H-11）、1.38（3H，s，H-13）、1.16（3H，s，H-12）和2組亞甲基信號：2.30（1H，d，J=7.0Hz，H-4a）、1.44（1H，m，H-4b）、1.99（1H，d，J=7.0Hz，H-2a）、1.35（1H，m，H-2b）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）譜中共13個碳信號。結合DEPT譜可知該化合物有5個季碳信號，2個仲碳信號，2個叔碳信號以及4個甲基信號。上述核磁數據與參考文獻［13］對照，基本一致（見表1），確定化合物4為3S，5R-dihydroxy-6R，7-mestigmadien-9-one。

化合物5：無色油狀物。TLC板上，紫外燈（254nm）下有一暗斑，10%的硫酸乙醇溶液（V/V）顯色呈淡棕色。HR-MS給出其準分子離子峰m/z 247.132 3［M+ Na］+，推測其分子式為C13H20O3（Calc.C13H20O3Na，247.130 5）。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）譜的低場區有1個明顯的單峰：δ 5.99（1H，s，H-8）；中高場區有1個多重峰，根據峰面積知為1個次甲基質子信號：4.31（1H，m，H-3）；在高場區有4組單峰，均為甲基峰：2.27（3H，s，H-10）、1.42（3H，s，H-11）、1.39（3H，s，H-13）、1.11（3H，s，H-12）和2組亞甲基信號：2.23（1H，ddd，J=2.0，3.5，13.0 Hz，H-4a）、1.36（1H，m，H-4b）、1.93（1H，ddd，J=2.0，4.0，12.5 Hz，H-2a）、1.35（1H，m，H-2b）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）譜中可見13個碳信號，結合DEPT譜可知有5個季碳，2個仲碳，2個叔碳和4個甲基。碳譜數據與化合物4比較，非常相近，碳譜中除8、9、10相差值分別為0.4、1.2、1.1 ppm之外，其余的差值不超過0.2 ppm，說明化合物5和化合物4為同分異構體。上述核磁數據與參考文獻［13-14］相對照，基本一致（見表1），確定化合物5為3S，5R-dihydroxy-6S，7-mestigmadien-9-one。

表1　化合物1～6的碳譜數據

化合物6：棕色油狀物。TLC板上，紫外燈（254nm）下有一明顯的暗斑，10%的硫酸乙醇溶液（V/V）顯色呈黃綠色。HR-MS給出其準分子離子峰m/z 245.115 4［M+Na］+，確定其分子式為C13H18O3（Calc. C13H18O3Na，245.114 8）。1H-NMR（500 Hz，CDCl3）譜的低場區有3組峰，其中2組為d峰：δ 6.85（1H，d，J= 15.5 Hz，H-7）和6.48（1H，d，J=15.5 Hz，H-8）.提示存在一對反式耦合的烯氫；另一組為s峰：δ 5.96（1H，s，H-4），知化合物中還存在一個雙鍵；高場區可觀察到4個單峰：δ 2.31（3H，s，H-10）、1.90（3H，s，H-13）、1.11（3H，s，H-11）和1.03（3H，s，H-12），知為甲基信號；中高場區的2組信號δ 2.50（1H，d，J=17.5 Hz，H-2a）和2.34（1H，d，J=17.5 Hz，H-2b）為飽和碳上的同碳耦合質子。13C-NMR（125MHz，CDCl3）譜結合DEPT譜知該化合物有4個季碳，4個伯碳，1個仲碳和4個叔碳。在最低場區觀察到有δ 197.8和197.5，知該化合物含2個α，β-酮羰基。低場區的其余4個碳：δ 161.1、145.5、130.4、127.6，為氫譜中所推出的兩個雙鍵的碳信號。而高場區的δ 28.3、24.4、23.0、18.8為4個甲基的碳信號。上述核磁數據與參考文獻［15］對照，基本一致，確定化合物6為R－（－）－去氫催吐蘿芙葉醇［R-（－）-dehydrovomifoliol］。

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Isolation and identification of chemical constituents from Nelumbinis Folium（Ⅲ）

XIA Ming-hui1，PENG Shuang2，ZHAO Jing1，HAN Li-feng1，ZHANG Yi1，WANG Tao1
（1．Key Laboratory of Traditional Chinese Medicinal Chemistry and Analytical Chemistry of Tianjin，Tianjin 300193，China 2.Qinghai Lake Pharmaceutical Company Limited，Xining 810000，China）

［Objective］To investigate the chemical constituents of the lotus leaf for futher research and development.［Methods］The chemical components were obtained by using several chromatographies，such as silica gel，ODS，Sephadex LH-20 and PHPLC，and their structures were identified by the physico-chemical methods，MS，NMR spectra and comparing with literatures.［Results］Six compounds were isolated from 70%ethanol extract of lotus leaves and identified as sarmentol F（1）；（3S，5R，6S，7E，9R）-7-megastigmene-3，6，9-triol（2）；（3S，5R，6R，7E）-3，5，6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one（3）；3S，5R-dihydroxy-6R，7-mestigmadien-9-one（4）；3S，5R-dihydroxy-6S，7-mestigmadien-9-one（5），and R-（-）-dehydrovomifoliol（6）.［Conclusion］Compounds 1～6 are obtained from Nelumbo Adans.for the first time.

Nelumbinis Folium；chemical constituents；structure identification

R285.5

A

1673－9043（2015）02－0096-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.08

天津市高等學?？萍及l展基金一般資助項目（2012 0203）；高等學校博士學科點專項科研基金（20121210110007）。

夏明輝（1990-），女，碩士研究生，主要從事中藥藥效物質基礎研究。

王濤，E-mail:wangt@263.net。

（2014-12-14）