復方血栓通膠囊改善腎功能機制研究*

張　茜，肖新華，黎　明，李文慧，于　淼，張化冰，平　凡，楊國華

·中藥研究·

復方血栓通膠囊改善腎功能機制研究*

張茜，肖新華，黎明，李文慧，于淼，張化冰，平凡，楊國華

（中國醫學科學院，北京協和醫學院，北京協和醫院內分泌科，衛生部內分泌重點實驗室，北京 100730）

［目的］研究復方血栓通膠囊對糖尿病腎病（DN）大鼠24 h尿白蛋白、尿肌酐、血肌酐和血尿素氮等相關代謝指標的影響，及應用基因芯片探討復方血栓通膠囊改善DN大鼠腎功能的機制。［方法］選用SD大鼠45只，高脂喂養/鏈尿佐菌素（STZ）注射法制備DN模型，將DN成模大鼠40只隨機分為小劑量、中劑量、大劑量血栓通組［分別給予0.3、0.6、1.2 g/（kg·d）的血栓通粉末懸濁液］、DN模型組（給予生理鹽水）。另外選用SD大鼠10只為正常對照組（給予生理鹽水），均連續灌胃12周。每月末測定大鼠空腹血糖（FBG）和體質量。3個月末測定大鼠24 h尿白蛋白、尿肌酐、血肌酐和血清尿素氮水平。取大鼠腎臟組織進行Illumina基因芯片實驗以期從整體基因角度揭示復方血栓通膠囊改善腎功能的機制。實時定量PCR實驗驗證基因芯片的結果。［結果］復方血栓通膠囊能以劑量依賴的方式降低24 h尿白蛋白、血肌酐和血清尿素氮，升高尿肌酐（P＜0.05或P＜0.01）。基因芯片顯示大劑量血栓通組較模型組有67個基因顯著改變，其中34個上調，33個下調。實時定量PCR實驗發現大劑量血栓通組膠原蛋白1型1（Col1a1）、結締組織生長因子（Ctgf）和轉化生長因子1（Tgfb1）基因較模型組顯著下調，細胞色素P450家族2亞族C肽23（Cyp2c23）和Nephrin-1（Nphs1）顯著上調。［結論］復方血栓通膠囊能有效改善DN大鼠腎臟功能，其機制可能涉及Bmp2-Tgfβ-Ctgf通路，Cyp2c23和足細胞損傷修復。

復方血栓通膠囊；基因芯片；糖尿病腎病；足細胞

糖尿病腎病（DN）是糖尿病嚴重的并發癥之一。新近研究發現，一些中藥制劑在逆轉和治療DN中有很好的療效，如糖腎康膠囊，益腎化瘀沖劑等［1-2］。復方血栓通膠囊是由三七、黃芪、丹參和玄參4味藥組成的復方，具有改善血液流速和溶解血塊的作用。以往研究發現血栓通膠囊能夠降低DN大鼠24 h尿蛋白，改善腎小管基底膜厚度［3］。在DN患者的研究中也證實了這一點［4］。但是復方血栓通膠囊改善腎臟功能的機制還有待研究。基因芯片技術作為一種先進的高通量檢測技術，具有靈敏、準確、高信息量等優點，可以對個體生物的大量基因表達信息進行高速檢測和分析。本研究旨在研究復方血栓通膠囊對DN大鼠24 h尿白蛋白、尿肌酐、血肌酐和血尿素氮等相關代謝指標的影響，且應用基因芯片從整體上探討復方血栓通膠囊改善DN大鼠腎功能的機制。

1　材料與方法

1.1動物分組及處理5周齡雄性SD大鼠，購自中國醫學科學院動物研究所 ［SCXK（京）-2011-0010］。45只SD大鼠構建DN模型：給予4周高脂飼料喂養（豬油10%，糖20%，膽固醇2.5%，膽酸鹽1%，常規鼠飼料66.5%，購自中國醫學科學院動物所）后，單次腹腔注射1%鏈脲佐菌素（STZ）30 mg/kg（Sigma公司）。1周后檢測空腹血糖（FBG，禁食6 h，取尾靜脈血，葡萄糖氧化酶法），FBG＞16.7mmol/L者（n= 40）入組。DN組按照隨機數字表法隨機分為模型組，小劑量、中劑量和大劑量血栓通組（各組n=10），分別灌胃生理鹽水、0.3、0.6、1.2 g/kg的血栓通粉末懸濁液，每日1次。另外10只正常健康SD大鼠為正常對照組。每4周測定FBG和體質量。12周末，留取24 h尿測定24 h尿白蛋白和尿肌酐，取血測定血清肌酐和尿素氮。取腎臟，立即放在液氮中保存。

1.2相關指標測定于開始灌胃當天，喂藥后4、8、12周測量大鼠體質量、FBG。灌胃12周后，將大鼠放置于代謝籠，留取24 h尿，酶法測定24 h尿白蛋白和尿肌酐。12周末，禁食6 h，處死，摘眼球取血，酶法測定血肌酐和血清尿素氮。

1.3基因芯片實驗

1.3.1腎臟組織總核糖核酸（RNA）抽提處死小鼠后，立即取腎臟組織置液氮凍存備用。小劑量、中劑量和大劑量血栓通組和模型組各自取3個腎臟樣本進行基因芯片實驗。Trizol法提取 RNA（Qiagen）。紫外吸收測定法（NanoDrop ND-1000）測定RNA含量，變性瓊脂糖凝膠電泳觀測18 s和28 s條帶亮度，對RNA質量進行鑒定。

1.3.2Illumina基因芯片實驗本研究應用Illumina大鼠Ref-12表達譜芯片，包含22 228個大鼠基因。按照Illumina TotalPrep RNA擴增試劑盒操作程序進行RNA擴增。總RNA逆轉錄得到第一鏈互補脫氧核糖核酸（cDNA），再合成第2鏈cDNA。cDNA純化，體外轉錄合成補充核糖核酸（cRNA），cRNA純化，雜交，洗滌，染色，干燥進行芯片掃描（Illumia芯片掃描儀）。

1.3.3芯片數據處理應用Illumina微珠芯片掃描儀掃描芯片，Illumina微珠芯片圖像分析軟件對芯片灰度掃描圖進行分析處理。應用立方樣條函數法（cubic spine）對原始數據歸一化處理。差異基因的篩選標準為大劑量血栓通組（或小劑量、中劑量血栓通組）與模型組相比，倍比值＞2或者＜-2，而且P＜0.05。應用Cluster和TreeView軟件進行聚類分析。為了將差異基因按照生物學功能進行分類，使用DAVID軟件和KEGG數據庫進行基因分類（GO）分析。

1.4實時定量PCR驗證實驗為了驗證基因芯片實驗，挑選了5個基因進行實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）實驗。這5個基因是：膠原蛋白1型1（Col1a1）、結締組織生長因子（Ctgf）、細胞色素P450家族 2亞族 C多肽 23（Cyp2c23）、Nephrin-1（Nphs1）和轉化生長因子1（Tgfb1）。留取小劑量、中劑量、大劑量血栓通組和模型組大鼠腎臟各3只，按照前面所述方法提取RNA，逆轉錄為cDNA，引物設計見表1。管家基因GAPDH。實時定量PCR在ABI 7700系統上完成。

表1　實時定量PCR實驗引物設計Tab.1　Oligonucleotide sequences for quantitative real time PCR analysis

1.5統計學處理采用SPSS 18.0進行數據分析，定量指標以均數±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnet’s T3法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1復方血栓通膠囊對DN大鼠體質量的影響DN大鼠較對照組體質量顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。血栓通治療組較模型組體質量無統計學差異，見表2。說明復方血栓通膠囊對DN大鼠體質量無影響。

表2　復方血栓通膠囊對DN大鼠體質量的影響Tab.2　Effects of FXST on body weight of DN ratsg

表2　復方血栓通膠囊對DN大鼠體質量的影響Tab.2　Effects of FXST on body weight of DN ratsg

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別　1個月　2個月　3個月對照組　492.4±37.0　543.4±40.1　592.6±29.9 DN模型組　455.0±32.4*452.8±30.0**459.2±42.7**小劑量血栓通組　486.8±37.7*479.5±32.7**487.9±34.7**中劑量血栓通組　472.8±29.4*470.2±36.7**471.8±38.9**大劑量血栓通組　420.3±33.0*425.1±32.4**439.8±39.6** n 10 10 10 10 10 0個月446.6±18.3 450.0±42.8 481.4±32.4 468.2±27.1 047.6±39.3

2.2復方血栓通膠囊對DN大鼠FBG的影響DN大鼠FBG較對照大鼠顯著升高（P＜0.01）。血栓通治療組較模型組大鼠FBG差異無統計學意義（見表3）。說明復方血栓通膠囊對DN大鼠FBG無影響。

表3　復方血栓通膠囊對DN大鼠FBG的影響（Tab.3　Effects of FXST on FBG of DN ratsmmol/L

表3　復方血栓通膠囊對DN大鼠FBG的影響（Tab.3　Effects of FXST on FBG of DN ratsmmol/L

注：與對照組比較，**P＜0.01。

組別　1個月　2個月　3個月對照組　6.3±0.7　6.4±0.5　6.7±0.3 DN模型組　18.9±4.1**19.2±5.3**19.4±6.0**小劑量血栓通組　17.8±6.2**19.4±4.5**17.4±4.6**中劑量血栓通組　17.4±5.8**18.7±5.9**19.5±3.7**大劑量血栓通組　18.1±4.9**17.8±5.2**18.4±3.5** n 10 10 10 10 10 0個月6.5±0.6 19.6±3.4** 18.4±3.1** 19.2±2.5** 18.9±2.7**

2.3復方血栓通膠囊對DN大鼠腎功能生化指標的影響DN大鼠尿肌酐較對照組顯著下降（P＜0.05），24 h尿白蛋白，血肌酐和血清尿素氮顯著升高（P＜0.05）。小劑量、中劑量和大劑量血栓通組24 h尿蛋白、血肌酐和血清尿素氮較DN組顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。小劑量、中劑量和大劑量血栓通組尿肌酐較DN組顯著上升（P＜0.05），見表4。說明復方血栓通膠囊能以劑量依賴的方式顯著升高尿肌酐，降低24 h尿白蛋白，血肌酐和血尿素氮，改善DN大鼠腎功能。

表4　復方血栓通膠囊干預12周對DN大鼠24 h尿白蛋白，尿肌酐，血肌酐和血清尿素氮的影響Tab.4　Effects of FXST treatment on 24 h urinary albumin，urinary creatinine，serum creatinine and serum urea nitrogen in DN rats

表4　復方血栓通膠囊干預12周對DN大鼠24 h尿白蛋白，尿肌酐，血肌酐和血清尿素氮的影響Tab.4　Effects of FXST treatment on 24 h urinary albumin，urinary creatinine，serum creatinine and serum urea nitrogen in DN rats

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與DN模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　尿肌酐　血肌酐血清尿素氮（mmol/L）（μmol/L）（mmol/L）對照組　9.36±1.52　49.4±3.5　7.6±1.7 DN模型組　2.44±0.57**81.0±7.8*20.2±2.5**小劑量血栓通組　3.05±0.84**#71.4±6.1*#16.2±1.6**#中劑量血栓通組　3.29±0.49**#75.8±4.1*#15.3±2.4**#大劑量血栓通組　3.42±0.31**#68.5±7.9*#13.4±2.5*##n 10 10 10 10 10 24 h尿白蛋白（mg/d）24.9±3.9 72.6±5.4** 58.4±6.4**#52.9±3.6**#43.5±4.5*##

2.4基因芯片結果小劑量血栓通組較模型組有28個基因表達改變，其中15個上調，13個下調。大劑量血栓通組有67個基因表達改變，其中34個上調，33個下調，其中，9個基因在小劑量血栓通組也存在差異表達。對大劑量血栓通組的差異表達基因進行GO分析，發現67個差異表達基因分為27個GO分類。將這27個GO分類進行DAVID聚類分析，結果顯示3個聚類（P＜0.05，倍比值＞2.0，且聚類評分＞2.0）。3個聚類的評分在2.62到3.66之間，見表5。其中，第1個聚類包括3個GO分類：營養、營養水平和細胞外刺激。第2個聚類包括：膜聯囊泡、囊泡、胞漿膜聯囊泡和胞漿囊泡。第3個聚類包括：季胺轉運、陽離子轉運和胺轉運。KEGG通路分析顯示大劑量血栓通組差異基因富集在2個通路上（P＜0.10，倍比值＞2.0），見表6。這2個通路是細胞色素P450通路和藥物代謝通路。

2.5實時定量PCR結果大劑量血栓通組Col1a1，Ctgf和Tgfb1基因較DN模型組相對表達量顯著降低，Cyp2c23和Nphs1基因較DN模型組相對表達量顯著增加（P＜0.05），見表7。其結果與基因芯片的結果一致。

表5　DAVID功能聚類分析Tab.5　DAVID function annotation cluster analysis

表6　KEGG通路分析Tab.6　KEGG pathway

表7　實時定量PCR和基因芯片的結果Tab.7　Results of fold change in gene expression measured by gene array and real time PCR

3　討論

本研究發現復方血栓通膠囊能以劑量依賴的方式，顯著降低DN大鼠24 h尿白蛋白，血肌酐和血清尿素氮，增加尿肌酐水平。以往研究也發現了復方血栓通膠囊具有改善腎臟功能的特點。Lang等［4］發現給予DN患者血栓通治療，能降低尿白蛋白和改善血液黏稠度。在DN大鼠中也發現了同樣的結果［3］。

復方血栓通膠囊包含4種成分：三七、黃芪、丹參和玄參。其中三七能修復KKAy小鼠腎小球損傷［5-6］。黃芪能降低血糖，具有抗氧化的作用［7］。Luo等［8］發現丹參能抑制高糖誘導的細胞分化和細胞外基質產生。

基因分類分析顯示大劑量血栓通組27個GO分類中，“膠原蛋白1型”的倍比值最高（倍比值: 276.3）。在大劑量血栓通組的差異表達基因中，有2個基因在這一GO分類中（Cola1，Col1a2）。足細胞是腎小球濾過屏障結構中的重要結構。足細胞和足細胞特異蛋白是早期腎小球病變尿標志物之一［9］。實時定量PCR實驗發現大劑量血栓通組Col4a4（-3.721倍）和Nphs1（2.520倍）顯著變化。Veiming等［10-11］發現DN患者腎小球膠原蛋白Ⅳ顯著增加。Nephrin是足細胞特異蛋白之一。尸檢結果發現糖尿病患者腎臟Nephrin表達下調［12］。本研究揭示復方血栓通膠囊可能通過下調Col4a4基因，上調Nphs1基因，阻止足細胞破壞，改善DN大鼠腎臟功能。

DAVID功能聚類分析中，本研究發現評分最高的功能聚類（倍比值：3.66）包括3個GO功能分類：營養，營養水平和對細胞外刺激的反應。這3個GO功能分類包括7個基因：Bmp2，Cubn，Adh1，Clk2，Zfp354a，Col1a1和Tgfb1。另外，本研究發現大劑量血栓通組Tgfb1（-2.550）和Ctgf（-3.266）基因顯著下調，并且實時定量PCR實驗證實了這一點。骨形成蛋白2（Bmp2）和轉移生長因子-β（Tgf-β）是激活素（activin）/骨形成超家族成員［13］，其在凋亡，損傷修復和細胞外基質形成中起重要作用［14］。Tgf-β在DN的腎臟肥大，纖維化/硬化表現中起到至關重要的作用［15-17］。Ziyadeh等［18］用抗TGF-β單克隆抗體長期治療糖尿病小鼠，發現能改善腎臟功能。結締組織生長因子（Ctgf）是一種主要的自分泌因子。Tgf-β能誘導Ctgf產生。有報道Tgf-β1能誘導足細胞中Ctgf mRNA產生和蛋白表達［19］。故推測復方血栓通膠囊能通過抑制Bmp2-Tgfβ-Ctgf通路，阻止細胞外基質蛋白的積累。

KEGG通路分析顯示大劑量血栓通組涉及2個通道的改變：細胞色素P450通路和藥物代謝通路。細胞色素P450家族2亞族C多肽23（Cyp2c23）在這2個通路上出現。基因芯片結果顯示大劑量血栓通組Cyp2c23顯著上調（倍比值：3.194）。有學者發現給與大鼠Cyp2c23能夠保護血管緊張素Ⅱ引起的腎損傷［20］。

總之，本研究觀察到復方血栓通膠囊能有效降低DN大鼠24 h尿白蛋白，血肌酐和血清尿素氮，升高尿肌酐，改善腎臟功能。復方血栓通膠囊對DN大鼠腎臟功能的改善作用是多通路的。本研究嘗試使用基因芯片來探討這些復雜的機制，并用實時定量PCR實驗驗證了這些結果。并且，本研究選用復方血栓通膠囊治療后的DN大鼠的腎臟作為實驗材料，為復方血栓通膠改善腎功能的機制研究提供了體內實驗的數據。但是，這些結果還需要進一步在蛋白水平進行證實。

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（本文編輯：高杉，于春泉）

Study of the mechanism of Fufang Xueshuantong capsule on kidney function

ZHANG Qian，XIAO Xin-hua，LI Ming，LI Wen-hui，YU Miao，ZHANG Hua-bing，PING Fan，YANG Guo-hua
（Department of Endocrinology，Peking Union Medical College Hospital，Key Laboratory of Endocrinology，Ministry of Health，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100730，China）

［Objective］To explore the effects of Fufang Xueshuantong capsule（FXST）on the kidney function in diabetic nephropathy（DN）rats and to investigate its possible mechanism.［Methods］SD rats were fed with high fat diet and injected with STZ to make diabetic nephropathy（DN）model.DN rats were randomly divided into four groups:low dose（XSTL），medium dose（XSTM），high dose（XSTH）FXST groups（treated with 0.3，0.6，1.2 g/kg/d FXST，respectively，n=10），and DN model group（treated with saline，n=10）.Normal rats were enrolled as normal group（treated with saline，n=10）.The fasting blood glucose，weight，24-h urinary albumin，urinary creatinine，blood creatinine and blood urea nitrogen were tested.Illumina Rat Ref-12 Expression BeadChip gene array experiment was done using kidney of rats.［Results］FXST could reduce 24-h urinary albumin，serum creatinine and serum urea nitrogen，and increase urinary creatinine in a dose dependent manner compared with those of DN model group（P＜0.05 or P＜0.01）.Gene array showed that FXST significantly changed expression of genes（34 increased，33 decreased）.Real-time PCR showed that relative levels for Col1a1，Ctgf and Tgfb1 were significantly decreased in FXST group，compared with the model group.Cyp2c23 and Nphs1 were increased.［Conclusion］FXST can moderate the kidney function in DN rats.The mechanism may be involved with BMP2-TGFβ-CTGF pathway，CYP2C23 and podocytes proteins.

Fufang Xueshuantong capsule；gene array；diabetic nephrapathy；podocyte

R587.1

A

1672-1519（2015）06-0359-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.06.11

北京協和醫院基金項目（2006119）；國家臨床重點專科建設項目（WBYZ2011-873）；國家自然科學基金項目（81170736，81300649）；中華醫學會臨床醫學科研專項基金-默沙東糖尿病研究項目（12030450345）；北京協和醫院中青年基金，協和青年基金（33320140022）；中央高校基本科研業務費專項基金。

張茜（1979-），女，博士，助理研究員，從事糖尿病研究工作。

肖新華，E-mail:xiaoxinhua@medmail.com.cn。

（2014-12-25）