桑仙降壓顆粒對自發性高血壓大鼠心肌VEGF及nm23的干預*

張蘊慧（山東中醫藥大學，高血壓國家中醫臨床研究基地，濟南250014）

桑仙降壓顆粒對自發性高血壓大鼠心肌VEGF及nm23的干預*

張蘊慧
（山東中醫藥大學，高血壓國家中醫臨床研究基地，濟南250014）

［目的］觀察桑仙降壓顆粒對自發性高血壓大鼠（SHR）心肌血管內皮生長因子（VEGF）及nm23的影響，探討其對高血壓病心肌血管生長促進因子、抑制因子的干預作用。［方法］SHR隨機分為3組，空白對照組、吲噠帕胺西藥對照組、桑仙降壓顆粒組，以Wistar大鼠為正常對照，4周及8周后觀察SHR心肌VEGF及nm23的表達。［結果］實驗前正常對照組與空白對照組相比VEGF及nm23蛋白光密度值差異均無統計學意義。實驗4、8周后相較空白對照組，桑仙降壓顆粒組VEGF表達明顯增多而nm23蛋白密度值顯著減少。［結論］桑仙降壓顆粒能增強VEGF的表達及降低nm23的蛋白密度值。

自發性高血壓大鼠；桑仙降壓顆粒；血管內皮生長因子；nm23

高血壓是最常見的慢性病，也是心腦血管病最主要的危險因素之一，近年來，國家日益重視高血壓的防治研究工作［1］。本研究以自發性高血壓大鼠（SHR）為動物模型，通過對SHR心肌血管內皮生長因子（VEGF）及nm23的干預，以觀測桑仙降壓顆粒對高血壓心肌血管生長促進因子、抑制因子的作用，以期為其能否對血管生長起到有益作用進行嘗試。

1　材料與方法

1.1動物與分組4周齡Wistar大鼠，18只，雌雄各半，體質量210～250 g，由山東醫科大學動物室提供［動物合格證號：SCXK（魯）20090001］。4周齡SHR，42只，雌雄各半，體質量200～240 g，由中國醫科院阜外心血管醫院提供（醫動字第01-108號）。以A標示正常對照組即Wistar大鼠組；SHR隨機分為B、C、D組，B：SHR給予蒸餾水為空白對照組，C：SHR給予桑仙降壓顆粒為實驗組，D：SHR給予吲噠帕胺為西藥對照組；觀測時相點：0組的觀測時間為Wistar大鼠、SHR4周齡；1、2的觀測時間為Wistar大鼠、SHR給藥后4周、8周。在3個觀測時間點分別觀測，隨機分組為A0、B0；A1、B1、C1、D1；A2、B2、C2、D2。每組6只。

1.2藥物桑仙降壓顆粒組方有桑寄生、淫羊藿、丹參、川芎等，由山東中醫藥大學中藥制劑室按正交實驗法優選工藝制成，每克含生藥6 g，臨用前加蒸餾水稀釋成含生藥0.8 g/mL的藥液。吲噠帕胺片每粒2.5 mg，由天津力生制藥股份有限公司提供，實驗前加生理鹽水適量，制備成濃度0.025 g/L混懸液，置4℃冰箱保存備用，使用前振蕩，充分搖勻。

1.3試劑Anti-Nm23-H1為北京博奧森生物技術有限公司產品；VEGF免疫組化染色試劑盒、生物素化山羊抗兔IgG，鏈霉親和素2生物素（SABC）和DAB顯色劑，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4實驗儀器METTLER AE20型電子分析天平，海特勒托利多（上海）儀器有限公司提供；康樂電熱恒溫水浴槽，上海醫療器件七廠提供；光學顯微鏡，由山東省中醫院病理科提供。

2　方法及檢測

2.1制備用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）體質量腹腔注射，麻醉后立即經腹主動脈注入4℃生理鹽水，切開下腔靜脈放血，待沖洗液干凈無色后，立即開胸，快速分離、摘取心臟，置入4℃生理鹽水中快速沖洗3次。

2.2VEGF蛋白含量檢測采用免疫組化SP法。結果判斷：參照AXIOTIS等標準［2］，由兩位病理醫生采用盲法（獨立檢測）在高倍鏡（×400）下讀片。每張切片高倍鏡下隨機選取10個不重復的視野（不足10個視野的，按實際觀察到的視野計數），共紀錄1 000個細胞，綜合染色強度和陽性細胞數量進行判定。1）按切片中細胞著色深淺評分：0分為細胞無顯色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。2）按陽性細胞數占同類細胞數的百分比評分：1分為＜25%；2分為≥25%且≤50%；3分為＞50%且≤75%；4分為＞75%。取1）、2）兩項評分的乘積作為總積分：0～3分為（-）；＞3分且≤6分為（+）；＞6分且≤9分為（++）；＞9分（+++）。染色結果由兩名病理醫師采取雙盲法評定。（-/+）為低表達，（++/+++）為高表達。

2.3nm23蛋白的表達采用免疫組化SP法。每張切片高倍鏡下隨機選取10個不重復的視野（不足10個視野的，按實際觀察到的視野計數），共紀錄1 000個細胞。其結果判定同VEGF。

2.4統計學分析方法數據采用SPSS18.0進行數據處理，計量資料數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較若方差齊采用LSD法，兩兩比較若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統計學意義。

3　實驗結果

3.1VEGF蛋白含量檢測實驗前，空白對照組VEGF蛋白光密度值與正常對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗4周，與正常對照組相比，空白對照組VEGF蛋白光密度值降低（P＜0.05）；與空白對照組比較，實驗組與西藥對照組VEGF蛋白光密度值均有顯著升高（P＜0.05）。實驗8周，空白對照組大鼠VEGF蛋白光密度值明顯降低，與正常對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；與空白對照組比較，實驗組與西藥對照組VEGF蛋白光密度值均非常顯著升高（P＜0.01）；實驗組與西藥對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1、表2、圖1。

3.2nm23蛋白表達實驗前，空白對照組大鼠nm23蛋白光密度值與正常對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗4周，空白對照組大鼠nm23蛋白光密度值升高，與正常對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；與空白對照組比較，西藥對照組與實驗組nm23蛋白光密度值均有降低，且差異有統計學意義（P＜0.01）。實驗8周，空白對照組大鼠nm23蛋白光密度值明顯升高，與正常對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；與空白對照組比較，西藥對照組與實驗組nm23蛋白光密度值均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；西藥對照組與實驗組相比差異無統計意義（P＞0.05）。結果見圖2、表3、表4。

表1　實驗前正常對照組和空白對照組VEGF蛋白光密度值積分比較分

表1　實驗前正常對照組和空白對照組VEGF蛋白光密度值積分比較分

注：與正常對照組比較，*P＞0.05。

組別正常對照組空白對照組n 6 6 VEGF蛋白光密度表達積分7.25±0.55* 7.18±0.48*

表2　實驗4周、8周后各組VEGF蛋白光密度值積分比較（分

表2　實驗4周、8周后各組VEGF蛋白光密度值積分比較（分

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組相比，△△P＜0.01，△P＜0.05；與西藥對照組相比#P＞0.05。

組別正常對照組空白對照組西藥對照組實驗組n 6 6 6 6實驗4周后7.19±0.49 5.11±0.33* 6.15±0.29△6.11±0.51△實驗8周后6.33±0.34 3.29±0.65** 4.32±0.45△△5.57±0.38△△#

圖1　VEGF蛋白表達（免疫組化染色×400）

4　討論

微血管損害存在于各期高血壓［3］，在高血壓及心、腦、腎靶器官病變的發生、發展和轉歸中發揮重要作用。因此，改善微血管損害應成為防治高血壓的有效措施［4］。促進血管新生是改善微血管損害的有效途徑，血管新生是指原有微血管內皮細胞經過生芽、遷移、增殖與基質重塑等形成新毛細血管的過程［5-7］。血管內皮細胞的增殖是血管新生發生最基本和最重要的環節，內皮細胞的遷移是血管生成的重要步驟［8-11］。VEGF是誘導微血管形成作用最強、特異性最高的血管生長因子［12］，能特異性地直接作用血管內皮細胞，引起血管內皮細胞增殖，促進血管形成，其作為血管內皮細胞的特異性有絲分裂刺激因子，與Flt/Flk兩個受體之間發生高度親和作用，在它們發生結合以后便表現出強大的刺激血管新生的作用，誘導血管內皮細胞的增殖、分化與遷徙，促進微血管形成。VEGF是目前唯一被證明對血管生成嚴格特異性的血管內皮生長因子，它在血管形成的起始、發展以及成熟過程中起到積極作用，是一種血管生成標志物［13-17］。

nm23基因是1988年美國Steeg等［18］用消減雜交分離的方法從小鼠黑色素瘤K-1735細胞系中發現并分離出的腫瘤轉移抑制基因。隨著進一步研究，發現nm23表達與VFGF表達明顯呈負相關，nm23低表達可能促進VFGF高表達，導致腫瘤血管生成［19］。由于nm23與VFGF在促進微血管生成方面具有協同作用，因此將nm23表達作為抑制因子引入到對心肌血管生長的觀測中。

圖2　nm23蛋白表達（免疫組化染色×400）

表3　實驗前正常對照組和空白對照組nm23蛋白光密度值積分比較分

表3　實驗前正常對照組和空白對照組nm23蛋白光密度值積分比較分

注：與正常對照組比較，*P＞0.05。

組別正常對照組空白對照組n 6 6 nm23蛋白光密度表達積分4.02±0.81* 4.45±1.01*

表4　實驗4周、8周各組nm23蛋白光密度值積分比較分

表4　實驗4周、8周各組nm23蛋白光密度值積分比較分

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與空白對照組相比，△△P＜0.01；與西藥對照組相比，#P＞0.05。

組別正常對照組空白對照組西藥對照組實驗組n 6 6 6 6實驗4周后3.82±0.54 6.87±0.65** 3.67±0.44△△3.71±1.13△△實驗8周后3.95±0.38 7.01±1.32** 4.85±0.58△△4.69±0.70△△#

研究表明桑仙降壓顆粒增加SHR心肌微血管密度，具有保護微血管的作用［20］。本研究以VEGF及nm23為觀測點，結果表明：實驗4周、8周后，與正常對照組相比，空白對照組VEGF蛋白密度值降低，而nm23蛋白密度值升高；但與空白對照組相比，實驗組與西藥對照組VEGF蛋白光密度值均明顯增加，nm23蛋白表達卻明顯降低，從而提示桑仙降壓顆粒能有效增加血管生長促進因子表達、降低抑制因子表達，可能對減少高血壓引起的微血管損害起到有益作用，其是否還可通過影響其他血管生成促進因子、抑制因子進而減輕高血壓及其靶器官微血管損害有待進一步研究。

［1］中國高血壓防治指南修訂委員會.中國高血壓防治指南2010［J］.中華高血壓雜志，2011，19（8）:701-704.

［2］Abraham JA，Mergia L，Whang JL，et al.Nucleotide sequence of a bovineclone encoding the angiogenic protein，ba2sic fibroblast growth factor［J］.Science，1986，233（4763）:545-548.

［3］Taddei S，Virdis A，Ghiadoni L，et al.Endothelial dysfunction in hypertension［J］.J Nephrol，1999，13（3）：205-210.

［4］Park JB，Schiffrin EL.Effects of antihypertensive therapy on hypertensive vascular disease［J］.Curr Hypertens Rep，2000，2（3）：280-288.

［5］戴國華，宋憲波，馬培澤，等.大鼠缺血心肌微血管內皮細胞血管新生的生物學特征［J］.天津中醫藥大學學報，2014，33（5）:278-281.

［6］田牛.微血管生成和血管退化［J］.微循環學雜志，2000，10 （3）:1-5.

［7］李廣斌，蘇金玲，姜希娟，等.心復康聯合骨髓間充質干細胞移植對瀕死心肌的保護作用［J］.天津中醫藥，2010，27 （2）:147-149.

［8］丁陽，李兵.血管內皮生長因子［J］.哈爾濱醫藥，2006，26（5）:73-75.

［9］陳洪，周迎春，黃桂瓊，等.補陽還五湯對心肌梗死后大鼠心肌微血管密度及血管內皮細胞生長因子-C表達的影響［J］.中國中醫藥信息雜志，2012，19（10）:24-26.

［10］Hanada D，Folkman J.Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic swith during tumorigenesis［J］.Cell，1996，86 （3）:353-364.

［11］王培利，雷燕，陳可冀.血管新生—治療心血管疾病的新策略［J］.中國中西醫結合雜志，2006，26（2）:173-176.

［12］Kim I，Kim JH，Moon SO，et al.Angiopoietin-2 at high concentration can enhance endothelial cell survival through the phosphatidy linositol 3-kinase/AKT signal ransduction pathway［J］.Oncogene，2000，19（39）：4549-4552.

［13］朱洪麗.VEGF在PDR中的表達及作用的研究［J］.國際眼科雜志，2014，14（12）：2223-2225.

［14］潘云松.血清VEGF水平對創傷組織修復的影響［J］.山東醫學高等專科學校學報，2014，36（4）：1-3.

［15］Brogi E，Wu T，Namiki A，et al.Indirect angiogenic cytokines upregulate BFGF and bFGF gene expression in vascular smooth muscle cel1，whereas hypoxFia upregulates BFGF expressian only［J］.Circulation，1994，90（2）：649.

［16］于曉紅，楊穎，周亞濱.益氣定悸方含藥血清對人臍靜脈內皮細胞VEGF表達影響的研究［J］.天津中醫藥大學學報，2013，32（2）:92-93.

［17］任守平，張榮位，金鴻濱.骨樂寧膠囊對大鼠骨折模型VEGF的影響［J］.天津中醫藥大學學報，2011，30（9）:163-164.

［18］Steeg PS，Bevilacqua G，Kopper L，et al.Evidence for a novel gene flssociated with low tumor metastastic potential［J］.J Natl Cancer Lnst，1988，80（3）：200.

［19］于冬梅，閻曉初，郭德玉，等.VEGF和nm23蛋白在膀胱移行細胞癌中表達及臨床意義［J］.第三軍醫大學學報，2006，28（21）：2182.

［20］張蘊慧.桑仙降壓顆粒對自發性高血壓大鼠心肌MVD 和ESM1蛋白表達的干預［J］.中國中醫急癥，2012，21（12）：1945-1947.

Intervention of Sangxian Jiangya granule on VEGF and NM23 of spontaneously hypertensive rats

ZHANG Yun-hui
（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014，China）

［Objective］To observe effect of Sangxian Jiangya granule on myocardial vascular endothelial growth factor（VEGF）and nm23，and to discuss the intervention of Sangxian Jiangya granule on the growth and inhibition factor of vascular endothelial cell.［Methods］Spontaneously hypertensive rats were randomly divided into 3 groups: control group，indapamide control group of Western medicine，Sangxian Jiangya group，using Wistar rats as normal control group.After 4 and 8 weeks，myocardial VEGF expression of nm23 was observed.［Results］Compared with the blank control group，in Sangxian Jiangya group the VEGF protein density was markedly increased and nm23 protein density was significantly decreased.［Conclusion］SangxianJiangya granulecould enhanceVEGFexpression and decrease nm23 protein density value.

spontaneously hypertensive rats；Sangxian Jiangya granule；VEGF；nm23

R285.5

A

1673-9043（2015）03-0152-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.03.07

山東省中青年科學家基金課題（2006 BS03047）；山東省自然基金課題（30873241）；泰山學者資金資助項目。

張蘊慧（1972-），副教授，碩士研究生導師，研究方向為中醫藥治療心血管疾病的臨床與實驗研究。

（2015-02-01）