從紅麻花藥和花瓣中提取高質量總RNA的方法

周瑤瑤　陳春妍　陳鵬　刁勇　周瑞陽

摘 要：紅麻（Hibiscus cannabinus L.）花藥和花瓣因含有較多的多糖、酚類等物質而較難提取高質量的RNA，本研究探索一種適用于紅麻花藥和花瓣高質量總RNA的方法以進行cDNA文庫構建等后續試驗。通過借鑒植物DNA的CTAB提取法，結合RNA的理化性質，在提取液中加入6%的β-巰基乙醇，并在開始裂解時加入1/10體積的5 mol·L-1 KAc和1/10體積的無水乙醇對去除多糖特別有效。結果顯示，利用該方法得到的RNA質量高，條帶清晰完整，檢測OD 260/280在1.8～2.1之間，OD 260/230在2.0～2.6之間，產量為花藥987.3 ng·μL-1，花瓣752.1 ng·μL-1。該方法提取的總RNA可直接用于mRNA純化，cDNA文庫構建及RT-PCR等后續分子試驗。

關鍵詞：紅麻；花藥；花瓣；RNA提取

中圖分類號：S563.5 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.004

A Method of Extracting High Quality Total RNA from the Anthers and Petals of Kenaf

ZHOU Yao-yao， CHEN Chun-yan，CHEN Peng，DIAO Yong，ZHOU Rui-yang

（Provincial Key Laboratory of Plant Genetics and Breeding， Guangxi University， Nanning 530005， China）

Abstract：The anthers and petals of Kenaf contain high content polysaccharide and polyphenol. An efficient method for high quality total RNA extraction from the anthers and petals of Kenaf is requisite for the following experiments such as cDNA library construction and so on. Based on the CTAB extraction method for plant DNA and combined with the physicochemical properties of RNA. 6% β-mercapto ethanol was added to extraction buffer and 1/10 volume 5 mol·L-1 KAc with 1/10 volume anhydrous ethanol was used in the initial cell disruption so as to remove polysaccharide from the anthers and petals. The result showed that by this improved method，high quality RNA could be obtained， and the band was clear and complete. A D260/D280 ratio ranged between 1.8 and 2.1. A D260/D230 ratio stand between 2.0 and 2.6. The RNA productivities from the anthers and petals of kenaf were 987.3 ng·μL-1 and 752.1 ng·μL-1 respectively. High quality RNA could be obtained by this improved RNA extraction protocol， and RNA was suitable for RT-PCR， mRNA purification， cDNA library construction and so on.

Key words：kenaf；anther；petal；RNA extraction

紅麻（Kenaf）是錦葵科（Malvaceae）木槿屬（Hibiscus）一年生韌皮纖維作物，學名為Hibiscus cannabinus L.，別名為洋麻、槿麻等。從紅麻中提取高質量的總RNA是進行紅麻基因表達研究的重要基礎，只有純度高、完整性好的總RNA才可用于mRNA純化、Northern雜交、構建cDNA文庫及差減文庫、Real-time PCR定量分析、蛋白質的體外翻譯等進一步研究。而紅麻的花藥和花瓣富含多糖、多酚、蛋白質和未知次級代謝產物，它們通常與RNA不可逆結合或與RNA共同沉淀，難以提取到高質量、高純度的RNA；另外，植物組織中存在RNase，在細胞破碎后釋放出來的RNA會被其分解，所以要采取有效措施抑制RNase并使之失活[1]。高質量的花藥和花瓣總RNA是進行紅麻分子育種的基礎，也為揭示細胞質雄性不育分子機理提供了重要保證。

目前，有關植物組織中RNA提取方法的報道已有很多，諸如Trizol法[2]、CTAB-PVP法[3]、鹽酸胍法[4]，酚-SDS法[5]及CTAB/酸酚法[6]等，這些方法已廣泛用于許多植物總RNA的提取。陳美霞等[7]比較了多種傳統的RNA提取方法，發現用熱硼酸法可以提取到紅麻福紅992葉片的總RNA。由于不同植物或同種植物的不同組織含有的糖類、酚類以及次級代謝產物的成分復雜，而且各不相同，如果這些物質不能得到有效的去除，RNA提取的產量和純度會受到影響，現已有報道在獼猴桃[8]、柿果[9]、香蕉果肉[10]、芍藥花瓣[11]、木薯[12]和荷花花瓣[13]等植物組織中成功地提取到總RNA，但是關于紅麻花藥和花瓣的總RNA提取尚未見報道。為純化mRNA以構建花藥及花瓣的消減雜交文庫，需要高質量的總RNA，本研究做了大量的探索實踐，比較了CTAB-乙醇沉淀法、商業化RNA抽提試劑盒（Takara RNAiso plus（Total RNA）提取試劑盒）、UNIQ-10離心柱法[14]以及筆者根據紅麻的生理生化特性改進的CTAB法，以獲得具有高質量、高純度的紅麻花藥和花瓣總RNA。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

紅麻P3A：紅麻CMS系材料；P3B：紅麻保持系材料。兩種材料由廣西大學周瑞陽教授提供。摘取花蕾期花藥和花瓣，立即用液氮預冷，于-70 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 前處理 提取前，為杜絕RNase存在而降解RNA，事先將提取過程中所用的所有器具（離心管，槍頭）均用0.1%的DEPC水浸泡處理12 h以上，試驗中所用到的試劑用DEPC處理水配制（Tris-HCl和SDS不可用DEPC直接處理）。研磨樣品用的研缽清洗干凈，用0.1%的DEPC處理至少12 h，然后高壓滅菌或者放置烘箱180 ℃烘烤6 h以上。

試驗過程中，應注意戴口罩，勤換手套（防止開離心蓋時污染蓋子內側進而引入RNase）。

1.2.2 RNA提取方法比較 （1） CTAB-乙醇沉淀法。根據劉洋等[3]報道的用CTAB-PVP法提取棉花各組織總RNA的研究加以改進， 將LiCl沉淀的過程改成在抽提之前加入1/10體積的5 mol·L-1 KAc去除多糖，在兩次氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提后取上清液，加入1/10體積NaAc和2.5倍體積無水乙醇。-20 ℃沉淀6 h，其余步驟一樣。

（2）CTAB-UNIQ-10柱式提取法。UNIQ-10 RNA離心純化柱購于上海生工生物工程技術服務有限公司，將純化柱和CTAB法結合使用，根據何海旺等[14]報道的用玻璃粉吸附植物核酸的方法，用UNIQ-10 RNA離心純化柱代替玻璃粉吸附柱，既節省時間，又提高RNA的吸附能力。

（3）商品化試劑盒。采用寶生物工程（大連）有限公司的Takara RNAiso plus（Total RNA）試劑盒提取紅麻P3A和P3B的總RNA，操作步驟按試劑盒說明書進行。

（4）本研究改進的CTAB法。根據CTAB-乙醇法做了一些改進，在研磨樣品時不將樣品轉移至離心管中，而是將提取液直接倒入研缽中，用無RNase處理的錫箔紙覆蓋，在后面的提取步驟中加入了去除多酚多糖的步驟。具體操作如下：1）取8 mL CTAB提取液加2%的PVP于65 ℃溫浴15 min直至PVP完全溶解，同時用液氮預冷研缽；2）稱取1 g左右花藥（或0.3～0.4 g紅麻花瓣）放于液氮預冷的研缽中研磨成粉末狀，立即將預熱的CTAB提取液（加6%β-巰基乙醇）倒入研缽中，將粉末完全覆蓋并均勻涂抹，用錫箔紙蓋住研缽，待裂解液完全解凍，用研棒充分研磨；3）分裝800 μL到2 mL離心管中，65 ℃水浴8 min，加入1/10體積的5 mol·L-1 KAc和1/10體積的無水乙醇，以及等體積的水飽和酚和氯仿∶異戊醇（24∶1），并渦旋震蕩5 min；4）室溫靜置2 min，12 000 r·min-1，4 ℃離心15 min；5）將上清液轉移至新的2 mL離心管中，加等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min（花瓣需要加入1/10體積的5 mol·L-1 KAc和1/10體積的無水乙醇）；6）如果中間蛋白層較多，重復步驟5）2次，吸取上清液時動作要慢，注意不要吸到蛋白層，而且上清液不宜吸取過多；7）上清液轉移至新的離心管中，加入1/3體積的8 mol·L-1 LiCl，-20 ℃下沉淀4 h；8）14 000 r·min-1，4 ℃離心30 min；9）棄上清，用400 μL 3 mol·L-1 LiCl輕微漂洗以去除殘留的多糖；10）加入200 μL STE buffer溶解RNA沉淀，再加入1/10體積NaAc和2.5倍體積無水乙醇。-80 ℃沉淀30 min；11）14 000 r·min-1，4 ℃離心20 min；12） 小心丟棄上清液，用1 mL70%的乙醇漂洗沉淀，14 000 r·min-1，4 ℃，5 min洗滌沉淀2次；13）室溫干燥RNA 5～10 min，溶于40 μL DEPC水中，電泳檢測完整性，保存于-80 ℃備用。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測 電泳槽在電泳前進行了預處理，采用1 mol·L-1 的NaOH浸泡2 h，然后用DEPC水沖洗晾干備用，用DEPC處理水配制1×TAE緩沖液，取3 μL提取的總RNA，于1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。

1.2.4 RT-PCR 為進一步驗證改進方法提取的總RNA的完整性和轉錄活性，采用Clontech公司的SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit反轉錄合成cDNA，步驟按照試劑盒說明書先合成cDNA第1鏈，再稀釋10倍后進行第2鏈合成（LD-PCR） 同時以獲得的cDNA為模板，以紅麻管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物（5′引物為5′-ACATAAAGGGTGGTGCCAAGAAAGT-3′；3′引物為5′-GGTTGCTGTATCCCCATTCGTTGT-3′）（該引物由本實驗室博士研究生趙艷紅提供）進行PCR擴增，PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 20 s， 50 ℃ 30 s， 72 ℃ 90 s， 32個循環； 最后72 ℃延伸10 min。用1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。該段GAPDH的PCR產物預期長度為635 bp。

1.2.5 從總RNA中抽提mRNA 將提取的總RNA收集到一個無菌無RNase的離心管中，用真空離心濃縮儀濃縮到500 μL，mRNA的提取用Promega公司的polyATtract mRNA Isolation Systems，按照試劑盒提供的操作指南進行。抽提完后，各取10 μL（總體積250 μL）用1.2%瓊脂糖凝膠于1×TAE緩沖液電泳檢測，剩余mRNA溶液濃縮到所需要的濃度后立即進行后續試驗，或短時間保存于-70 ℃。

2 結果與分析

2.1 RNA完整性分析

經瓊脂糖非變性凝膠電泳檢測，結果表明，CTAB-無水乙醇沉淀法能提取較純凈的紅麻花藥總RNA，有完整的28S、18S和5S條帶，但是RNA濃度較低，對于需求量大的文庫構建，此方法不能滿足試驗的要求；CTAB-UNIQ-10柱式提取法提取紅麻的花藥RNA，點樣孔較亮，存在多糖和蛋白質嚴重污染，同時還有DNA污染，RNA濃度低；Takara RNAiso plus（Total RNA）試劑盒提取紅麻總RNA未見28S和18S條帶，效果較差；如圖1所示，本研究改良的CTAB法提取得到的紅麻花藥總RNA濃度最高，28S、18S和5S譜帶清晰，28S條帶明顯亮于18S（其亮度為18S的2倍），無蛋白質、多糖污染，表明所提取的總RNA完整性較好。如圖2所示，用普通的CTAB法得不到紅麻花瓣總RNA，而按照提取紅麻花藥的方法得到的RNA含糖較多，通過抽提前向提取液加入1/10體積的5 mol·L-1 KAc和1/10體積的無水乙醇可有效將紅麻多糖和RNA分離。

綜合比較上述幾種RNA提取方法，結果顯示改進后的CTAB方法能徹底去除多糖、多酚、蛋白質和DNA，RNA條帶清晰，無拖尾現象，通過紫外分光光度計檢測，OD260/OD280值均在1.8～2.1之間，OD260/230值在2.0～2.6之間，符合后續試驗對于RNA完整性和純度的要求。根據OD260值計算RNA的濃度：RNA的濃度=稀釋倍數×OD260值×40 ng·mL-1，RNA產量較高，分別為花藥987.3 mg·μL-1，花瓣752.1 ng·μL-1（P3A和P3B的平均值）。

2.2 RT-PCR

以提取的總RNA為模板，按照Clontech公司的SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit反轉錄合成cDNA（圖3），由圖3可知花藥和花瓣的cDNA smear帶主要分布在0.5～2.0 kb，符合一般植物cDNA分布范圍。以此cDNA作模板擴增一段管家基因GAPDH，電泳結果顯示，成功擴增出目的片段，而且片段長度約為635 bp（圖4），與克隆測序得到的片段一致，由此說明提取的總RNA具有反轉錄活性，可以進行后續cDNA文庫構建等。

2.3 抽提mRNA情況

用本方法提取的總RNA穩定，保存時間較長，且經過真空離心濃縮后不降解（圖5），抽提得到的mRNA譜帶大小在0.5～3.0 kb，質量較好（圖6），可用于構建cDNA文庫及Real-time PCR等高精度的后續試驗。

3 結論與討論

在本研究中，提取紅麻花藥總RNA采用改進的CTAB法得率最高，質量和純度都能滿足試驗要求。CTAB-無水乙醇沉淀法雖然能得到完整的5S RNA，但起始花藥用量不宜太大，得率也較少，但是通過此法可以得到完整的小RNA，可以進行后續micro RNA，siRNA及基因表達調控的研究，有一定的應用價值；CTAB-UNIQ-10柱式提取法采用的是離心柱吸附（過濾膜）的方法，它同樣能吸附一定量的基因組DNA，特異性不強，吸附能力有限，得率低，同時由于柱子的機械阻隔作用，RNA單鏈可能會斷裂，得到RNA不完整，尤其是紅麻花藥含多糖較多，使提取液過于黏稠，過濾效率大大降低；采用Takara的RNAiso plus（Total RNA）試劑盒提取法，由電泳圖可知僅見有分子量很小的條帶，說明紅麻總RNA被降解。紅麻花瓣的總RNA提取則相對要困難得多，采用上述提取花藥的幾種方法，均得不到完整的RNA，而改進的CTAB提取方法則能提取到完整無污染的總RNA，說明1/10體積的5 mol·L-1 KAc和1/10體積的無水乙醇聯合去除紅麻中的多糖效果較好，試驗過程中注意花瓣起始量不能加太多，否則提取液粘稠度增加，RNA提取效率下降；采用6%的β-巰基乙醇大大抑制了RNase的活性，保證了RNA在細胞裂解后不被其降解；采用直接加提取液到研缽中有效避免了樣品轉移過程中外界RNase的污染，同時也使樣品一直保持在低溫狀態，RNA降解的機會大大降低。在前期摸索中也嘗試了天根的植物總RNA提取試劑盒（DP432）和上海生工的Trizol提取試劑盒，都得不到理想的RNA。

由于各種植物及植物的不同組織都有其各自的化學組成和結構特點，有的組織細胞壁厚，有的組織木質化程度高，不同組織中蛋白質、多糖、多酚以及未知的次生代謝物等物質含量各不相同，因此，在研究中無法用一套固定的操作方法去提取不同物種、不同組織的總RNA，只有在了解常用RNA提取方法的基礎上，結合本材料特有的化學組分進行有效地摸索和改進，才能找到最佳方案[15]。本研究通過總結并試驗前人在各種植物不同器官RNA的提取方法，結合紅麻組織器官的理化性質摸索出一種能有效去除紅麻中的多糖多酚等物質的RNA提取方法。本實驗室已應用該方法成功提取了根、莖（韌皮部）、葉的總RNA，質量和純度都很好，可以進行后續分子試驗。

RNA提取主要受以下幾方面因素的影響：（1）pH值。pH值主要影響DNA和RNA的分離，在pH值為5.3的酸性環境中，DNA和RNA分別進入有機相和水相，蛋白則被有機溶劑變性除去。水相經過再次變性和分相處理后只剩下RNA，后面經醇沉淀即可獲得[16]。本試驗中采用的水飽和酚（pH值為5.2）除去DNA，而醋酸鉀和醋酸鈉也都是照成一個低pH值的環境，使RNA更穩定。（2）多糖多酚。多糖多酚的存在使花藥特別是花瓣中總RNA的分離更加困難，主要是由于多糖的許多理化性質同RNA極為相似，通常情況下，多糖會和RNA纏繞在一起以復合體形式存在，在除去多糖的同時，RNA也會一同流失。同時多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進一步的分子生物學研究[17]。本試驗采用1/10體積的5 mol·L-1 KAc和1/10體積的無水乙醇在裂解細胞時即加入提取液中，提取效果較好，且對于花瓣這種含糖較高的組織，只加一次不足以去除全部多糖，需在后面有機溶劑抽提前根據需要再次加入，RNA得率明顯提高。同時，還可以輔加LiCl來選擇性沉淀RNA（可能會損失掉一些小分子的RNA）。（3）起始材料的加量。對于植物來說，由于多糖多酚等次生代謝產物是隨著量累積的，初始樣品量越多，不能充分研磨樣品，分離RNA的難度就越大。由于多糖造成提取液黏稠，在相同體積的裂解液下，花瓣起始加量要比花藥少。（4）環境。RNA很不穩定，極易被RNase降解，而RNase存在于吸頭、試劑瓶、皮膚汗液等，所以提取過程中所使用的器皿和試劑耗材等盡量做到無RNase，清潔的試驗環境，以及試驗過程中勤換手套等可以消除外源RNase污染，-70 ℃可保存半年不降解。

綜上分析，利用本方法提取的紅麻花藥及花瓣總RNA取得了較好的效果。提取到的RNA基本上排除了多糖、蛋白質和DNA的干擾，實踐證明其質量和純度完全滿足包括小分子RNA測序、構建消減雜交文庫、轉錄組測序等后續分子試驗要求。

參考文獻：

[1] 吳凱朝， 黃誠酶， 李楊瑞， 等. Trizol試劑法快速高效提取3種作物不同組織總RNA[J]. 南方農業學報， 2012， 43（12）：1 934-1 939.

[2] 孫德權， 郭啟高， 胡玉林， 等.改良Trizol法提取香蕉葉片總RNA[J]. 廣西農業科學， 2009（5）：162-164.

[3] 劉洋， 何心堯， 馬紅波， 等. 用CTAB-PVP法提取棉花各組織總RNA的研究[J].中國農業大學學報， 2006， 11（1）：53-56.

[4] Su X， Gibor. A method for RNA isolation from marine macroalgae[J]. Anal Biochem， 1988， 174：650-657.

[5] 夏蘭芹， 郭三堆. 棉花RNA的快速提取方法[J]. 棉花學報， 2000， 12（4）：205-207.

[6] 蔣建雄， 張天真.利用 CTAB/ 酸酚法提取棉花組織總RNA[J]. 棉花學報， 2003， 15（3）： 166-167.

[7] 陳美霞， 陳富成， 顏克偉， 等.紅麻葉片高質量RNA提取方法比較分析[J]. 福建農林大學學報：自然科學版， 2011， 40（6）：561-565.

[8] 陳昆松， 徐昌杰， 張上隆.富含多糖獼猴桃果實組織中總 RNA 提取方法的改進[J].植物生理學通訊， 1998， 34（5）：371-373.

[9] 山藍， 王保莉， 張繼澍. 從富含多糖和多酚的柿果中提取具轉錄活性 RNA 的方法[J].植物生理學通訊， 2002， 38（5）： 463-464.

[10] 馮斗， 張春發， 張穎. 一種適用于提取香蕉果肉 RNA 的方法[J]. 廣西農業生物科學， 2004， 23（3）：249-251.

[11] 黃鳳蘭，李長海，孫婷婷，等.芍藥花瓣總RNA的提取[J]. 生物技術通訊， 2005， 16（3）：282-283.

[12] 張根良，王文泉.木薯總RNA提取初步研究[J]. 廣西農業科學， 2008， 39（6）：713-716.

[13] 楊峰， 李創， 劉藝平， 等.荷花花瓣總RNA的提取方法[J]. 河南科學，2009， 27（10）：1 226-1 227.

[14] 何海旺， 徐春燕， 李文， 等. 玻璃粉吸附核酸及其在植物核酸提取中應用的研究[J]. 生物技術進展， 2012， 2（5）：359-365.

[15] 陳暉， 何海福.植物組織總RNA提取方法的進展研究[J].甘肅農業，2006（8）：226.

[16] 袁明珠， 溫柔， 劉吉升， 等.幾種植物材料中總 RNA的提取[J]. 分子植物育種， 2005， 3（2）：285-292.

[17] 李宏， 王新力. 植物組織RNA提取的難點和對策[J].生物技術通報， 1999， 15（1）：36-39.