微藻高CO2耐受機制及其在生物減碳領域的應用

李鳳娟，高大文，胡晗華

(1.城市水資源與水環境國家重點實驗室(哈爾濱工業大學)，150090哈爾濱;2.中國科學院水生生物研究所藻類生物學重點實驗室，430072武漢)

隨著工業的進步，人類過度依賴化石燃料，造成CO2排放量大增，導致環境惡化.作為主要的溫室氣體，全球CO2排放量迄今已達290億t/a，大氣中 CO2的質量分數也由 0.027%上升至約0.04%［1］.面對愈發嚴重的溫室效應及減排需求，國內外針對CO2減量開展了許多研究，而生物法固碳作為固碳處理技術之一，是減碳的重要方向.其順應自然法則，所需能源來自太陽能，具有安全、經濟、高效等優點，是目前環境友好型CO2減排的重要方法之一［2］.目前生物固碳的兩個大方向為植物固碳和微藻固碳，而利用后者進行CO2封存被認為是降低CO2水平最環保、安全和可持續的方式.微藻生長周期短、光合效率高［3］，可以完全回收CO2，減少CO2排放的同時降低了培養成本.此外，微藻含油量高，還可積累多種活性物質(蛋白質、多糖和色素等)，開發潛力巨大.同時，CO2的微藻生物減排結合其他過程如污水處理可以變得更經濟，在環境上又是可持續的［4］.由此可見，藻類在生物固碳領域具有相當廣闊的應用前景.使用來源于煤-熱電廠煙道氣中的CO2培養微藻已經有了成功的嘗試［5］.然而，由于對微藻生物減排CO2生理效應和高水平CO2馴化機制認識不足，在發展高效生物減排CO2的方法時遇到了很大難題.

微藻固碳領域的絕大多數研究都致力于CO2濃縮機制(CCMs)和相對較低CO2水平(＜5%)對微藻的影響.盡管微藻耐受高CO2水平這一現象已被發現超過40年［6］，其機制方面的研究仍然很少.高CO2耐受/馴化是個復雜的過程，涉及微藻細胞眾多功能的調整.了解其基本機制是富集CO2以增加大規模微藻培養的生產力，進而實現碳捕獲和生物質生產的先決條件.為此，從利用微藻進行高效固碳的優勢出發，綜述了微藻對高CO2耐受的機理，以期為更好地利用微藻進行高效CO2減排提供理論依據.

1 微藻高效固碳的基礎

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RubisCO)是藻類及高等植物的固碳關鍵酶，它的進化出現在24～38億年前，是地球歷史上的高CO2年代.當今約0.04%的大氣CO2質量分數是光合作用的限制因素，而光自養生物進化出了復雜的CCMs.通過這種機制促進CO2的吸收，使得RubisCO附近CO2的質量分數相對于大氣的水平增加1～3個數量級，以保持充分的光合作用［3］.因此，較低的CO2質量分數，比如2%～5%對于絕大多數當代光合自養生物是飽和的，而較高的CO2水平往往對其生長和光合作用有害.正是由于微藻RubisCO起源的年代大氣CO2水平比當今要高得多，使其具有低的CO2親和力，從這一角度看，微藻可以被認為是高CO2適應/馴化細胞［7］.有些生境CO2質量分數可以在大氣水平和高至10%之間急劇變化，如土壤表面和酸性環境等.因而，即使在現今CO2水平下，高CO2適應對微藻仍然具有重要的生態學意義.

基于微藻對CO2質量分數的耐受性可以簡單地將其分成CO2敏感和CO2耐受兩種類型.CO2敏感型(不耐受)的種類在通入小于2%～5%CO2時生長和光合作用即被抑制.耐受型的種類能夠應付5%～20%CO2，能夠耐受更高CO2質量分數的物種被稱為CO2極耐受型.盡管CO2極耐受型微藻并不多見，地球多變的生境及微藻廣泛的分布使發掘出不同特性CO2耐受藻株成為可能.目前，用于研究微藻對高CO2耐受的幾個常用物種包括小球藻屬 (Chlorella)、柵藻屬(Scenedesmus)、微擬球藻(Nannochloropsis)和綠球藻屬(Chlorococcum)的種類，研究的CO2質量分數高至100%［8-9］.通常，從極端環境中分離的物種能在很高的CO2水平(如＞40%)下快速增長，有的甚至在CO2超過60%時生長才受到抑制［10-11］.分離自酸性環境的微藻，由于 CO2是主要的碳源，沒有胞外碳酸酐酶(CA)，這種高CO2環境下生長/馴化的細胞通常缺乏CCMs，但其RubisCO有相對較高的CO2親和力，細胞通過利用跨細胞膜的pH梯度來促進CO2的擴散吸收，以保證光合作用所需的CO2得到充足的供應.在通入高CO2時，藻細胞可能先經歷一個延遲期，此時的生長速率明顯低于空氣培養條件時的細胞，CO2固定也下降，隨后，藻的生長速度加快.延遲期的長短與藻種及實際通入的CO2質量分數有關［12］.

2 微藻耐高CO2的可能機制

2.1 細胞內pH動態平衡的加強

高CO2條件下觀察到的光合作用的快速抑制，可能是由高CO2壓力下葉綠體間質的酸化引起卡爾文循環的關鍵酶失活所致.Pronina等［13］的研究表明，海灘綠球藻(Chlorococcum littorale)即使在高達40%的CO2水平下培養，其細胞質中的pH也沒有低于7.0.顯然，如何有效控制細胞內的pH對于高CO2耐受至關重要，這種控制可以通過從細胞質泵送質子進入液泡來完成.研究證實，高CO2可以導致微藻細胞質中的液泡大小和/或數目增加，同時伴隨著H+-ATP酶活性顯著增強［14］.此外，對于 CO2耐受種，還可以通過對硝酸鹽的吸收提高培養基中的pH.對赫氏顆石藻(Emilianiahuxleyi)和一種共生鏈帶藻(Desmodesmussp.)的研究表明，細胞通過吸收硝酸鹽以使培養基堿化，從而緩解高濃度CO2酸化產生的不利影響［15］.由此可見，高 CO2馴化以及利用微藻培養捕捉煙氣CO2，充足的NO3-供應是必須的.

將耐高CO2的海灘綠球藻轉至40%的CO2水平培養1 h，細胞內的pH就會下降［9］，而加入胞內CA抑制劑后這種效應可被消除.CA作為CCMs的一個主要成分，其活性的抑制將導致CCMs的完全或部分關閉.抑制或下調CCMs將使得碳酸氫鹽的利用受阻，減少由此導致的胞內pH的降低.許多研究顯示可耐受高質量分數CO2的微藻明顯缺乏CCMs.因此，迅速下調或關閉CCMs也是微藻適應高CO2水平的一個重要方式.

2.2 光合器官(PSA)的馴化

分離自鹽水池塘的海灘綠球藻能在高達60%CO2水平下快速生長.研究表明，將這種綠球藻轉移到高 CO2條件時，藻細胞 PSA(photosynthetic apparatus)發生了由狀態I到狀態II的快速轉換，光系統(PS)I的循環電子傳遞增加，以生成維持藻細胞pH動態平衡所必需的額外 ATP［16］.PSA 狀態轉換的一個常見原因是NADPH的積累導致的質體醌庫的減少，這種情況通常是由于一種壓力因素(如CO2質量分數升高)將光合作用暗反應抑制到一定程度而產生［17］.因此，PSI/II比率的增加表明，高 CO2耐受性需要增加PSI捕光天線的大小.事實上，在轉移到高CO2條件的幾天內，相應的變化已經在高CO2耐受微藻的 PSA中觀察到［12］.值得注意的是，該PSI/II比率的變化是可逆的，可以回到其初始的水平，這可能是由于微藻細胞整體馴化到高CO2或CCM的活性下降，導致對ATP的需求減少.與此相反，不耐受高 CO2的杜氏鹽藻(Dunaliella salina)缺乏狀態轉換的響應，而且在高CO2條件下出現 PSI損傷［18］.另外，與在大氣CO2水平培養相比，CO2質量分數升高可減輕高CO2耐受的蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa)和斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)高光誘導的光抑制，且從光抑制恢復的速度更快.相反，CO2敏感型的萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)光抑制在這種條件下更為明顯［7］.

2.3 脂肪含量及組成的調整

通常認為，適度增加(2%～5%)CO2質量分數可以促進微藻細胞的生長及脂質積累［19］.當CO2水平從 0.04%增至 5%時，一種柵藻(Scenedesmus obtusiusculus)細胞的中性脂質量分數從15%提高到55%，相應地碳水化合物減少［20］.對其他許多綠藻的研究也得到相似的結論［21］.對 CO2耐受種而言，脂質(特別是甘油三酯)可以作為過剩光合固碳產物的一個庫，過量的CO2最終流向脂質的合成.由此看來，脂質合成代謝與CO2耐受密切相關.然而，不同藻種脂質變化對高CO2的響應存在差異，特別是當CO2質量分數超過10%后，提高CO2質量分數并不總是能增加細胞的總脂含量.研究表明，在高CO2耐受的柵藻中，提高CO2質量分數到20%，總脂含量減少，但中性脂和胞內游離脂肪酸的含量增加.高質量分數CO2條件下，從頭合成脂肪酸受到促進，總脂肪酸含量顯著升高，這些脂肪酸可能流向脂酰基最終形成甘油三酯，也可能在細胞內積累.

除總脂或總脂肪酸含量的變化，提高CO2質量分數還會引起脂質和脂肪酸組成的改變.Tang等［22］的研究顯示，增加CO2質量分數促進C18多不飽和脂肪酸的合成.與這一結論相反，對一種CO2敏感的鹽藻的研究表明，短期的高CO2質量分數處理抑制脂肪酸的延伸與去飽和.在高CO2條件下，由于脂肪酸修飾酶類的活性可能維持不變，并不足以轉換過量涌入的從頭合成脂肪酸.由此導致鹽藻細胞主要的半乳糖脂——單半乳糖二酰甘油酯(MGDG)中的C16飽和脂肪酸和C18單不飽和脂肪酸的比例增加.MGDG中飽和脂肪酸含量的增加可能改變細胞的膜結構.

3 微藻高CO2響應的分子機制

如上所述，微藻可以通過改變其光合特性如CCMs來適應高CO2條件.高CO2條件下生長的一些綠藻通過喪失CA和無機碳主動運輸系統來下調CCMs，以避免因過量無機碳積累引起的二次抑制效應.對萊茵衣藻的研究表明，高CO2下藻細胞胞外蛋白質組成發生了急劇的變化［23］.蛋白質組學的分析顯示，高CO2誘導許多配子發育相關蛋白質的表達，但其與高CO2耐受的關系并不清楚.一種可能的解釋是，高CO2下生長的細胞需要更多的氮源，往往容易達到氮限制狀態，在此條件下光呼吸的抑制將減少氮的固定，由此NH4+水平降低.細胞內NH4+水平的下降可以誘導萊茵衣藻配子發生相關基因的表達.

此外，對藍藻的研究表明，CO2質量分數與無機氮同化有密切的聯系，可能影響細胞對氮的吸收.聚球藻 (Synechococcussp.)PCC7942高親和碳酸鹽轉運子cmpABCD的分子結構與硝酸鹽/亞硝酸鹽轉運子nrtABCD非常相似［19］.高親和硝酸和亞硝酸鹽轉運子(HANT/HANiT)的表達是由低CO2而不是NH4+觸發的［24］.因而，在利用 CO2時必須考慮無機氮的影響.

除胞內CA外，許多微藻還有胞外CA.與前面分析相反，衣藻中一個定位于周質腔的α-型CA，CAH2可受高CO2條件誘導.盡管表達量低，受高CO2誘導的機理仍不清楚.衣藻中一個可能與銨和/或CO2轉運相關的蛋白Rh1也受高CO2的誘導，Rh1表達下調的衣藻突變體在高CO2條件下的生長受到明顯抑制［25］.

與研究較多的低CO2誘導機制相比，微藻在分子水平上對高CO2響應機制的研究才剛剛開始.深入研究微藻對高CO2響應的機制，有助于理解微藻如何響應環境CO2升高，也利于揭示細胞的整個代謝網絡如何調控，以合理通過各種手段提高固碳效率，為大規模養殖藻類時最大化高CO2條件下的藻生物量提供理論依據.根據已有的研究進展，Baba等［7］總結了高CO2下衣藻的碳利用及光呼吸.圖1顯示，高CO2下HCO3-不能直接由胞外轉運至胞內，而胞外CA可能上調，碳以CO2的形式經自由擴散或Rh主動運輸進入細胞內，胞內的CA可能活性下調或降解，CO2依次進入葉綠體的蛋白核中，在RubisCO作用下固定形成有機物.高CO2下藻細胞的光呼吸受到抑制.

圖1 高CO2下萊茵衣藻對碳利用的模式［7］

4 耐高CO2微藻培養的應用

電廠煙道氣是 CO2、N2、O2、SOx、NOx和粉塵等的混合物，其中CO2質量分數可達15%［26］，是CO2排放的主要來源之一，占全球CO2排放量的7%以上［27］.通常，SOx和NOx對藻類的培養也有不利影響［28］.如果含高質量分數CO2的煙道氣不經預處理直接用于培養微藻，將簡化培養程序，同時可降低生產成本.已有利用藍藻和綠藻進行煙氣減排的研究報道，根據這些結果，許多耐高質量分數CO2微藻對中等水平的SOx和NOx(體積分數約 150×10-6)也 具 良 好的 耐 受 性［29-30］.Yoshihara等［31］報道，微擬球藻在通入 100×10-6的NO時可以正常生長.Matsumoto等［32］的研究表明，扁藻 (Tetraselmissp.)可耐受含 185×10-6的SOx和125×10-6的 NOx以及14.1%CO2的煙道氣.岳麗宏等［9］篩選出的一株小球藻ZY1可在10%～15%的 CO2環境中保持旺盛生長，還可耐受50×16-6的 SO2和 300×10-6的 NO.CO2生物減排的另一個重要功效是在CO2固定過程中產生的生物質可以被轉化為生物燃料.盡管生物燃料生產成本遠高于化石燃料，且微藻培養過程中消耗與產出的能量相當，但生物燃料包括微藻生物質在替代減排上的潛力巨大，使得微藻生物質仍被認為是最有前途的生物燃料之一.利用高CO2培養微藻在提高生物量的同時可增加油脂產率，進而控制培養成本.Chiu等［21］的結果表明，半連續系統中的眼點微擬球藻 (N.oculata)在通入5%～15%的CO2質量分數下生長良好，脂質積累從對數期的31%增加至穩定期的50%.Kishimoto等［33］利用CO2作為碳源，培養1周后杜氏鹽藻生物產量達1.0 g·L-1，顯示出其有效的生物燃料生產和固定CO2的能力.杜氏鹽藻是一種嗜鹽綠藻，可在無需消毒的高鹽度條件(氯化鈉水溶液6%)下生長，在大規模培養同時進行CO2減排時具有很大的優勢.此外，還可以積累高達10%以上的β-胡蘿卜素，為生物減排CO2提供了商業利益的新途徑.因而，將生物燃料生產、CO2減排和高附加值的次生代謝物的生產結合起來，是實現利用微藻進行經濟減排的有效途徑.

另外，微藻CO2的固定還可與廢水處理相結合進行.Yun等［34］用從煉鋼廠排出的廢水培養普通小球藻(C.vulgaris)，當藻類通入15%的CO2培養時，不控制 pH，在廢水中補充一定量的磷，CO2固定率可達 0.6 g·L-1·d-1，氨的去除率為22 g·m-3·d-1.市政廢水的處理非常昂貴且在技術上有挑戰性，微藻培養可以轉移污水中的N和P，有助于避免河流與湖泊富營養化的危害.劉玉環等［35］嘗試利用高產油柵藻 (Scenedesmus dimorphus)進行市政廢水處理和火電廠煙道氣利用.結果顯示，在高達33.3%的CO2條件下，該柵藻可以高效利用市政廢水中的N和P.污水處理和微藻CO2固定的組合，提供了生物固碳，從廢水中除去氮、磷和金屬，同時獲得生物燃料的途徑，且無需使用寶貴的淡水資源，既可節約營養物質又可帶來環境效益.

5 結語與展望

許多微藻能耐受中等水平的CO2，而能夠耐受極端CO2質量分數(20%～40%或更高)的物種不常見.因而，為利用微藻高效捕獲CO2，首先需要分離出更多高CO2耐受的微藻種類.欲實現污水處理與微藻固碳的結合，可考慮在污水處理單元分離篩選更快利用氮、磷等營養物的藻種.其次，通過深入研究微藻對高CO2耐受的機制，以利用生理或遺傳手段應對高CO2的傷害也是行之有效的方法.

基于高CO2耐受和有效利用溫度較高的煙道氣考慮，可以從如間歇泉和溫泉等極端環境分離藻種.培養時可增加培養基中硝酸鹽濃度以及利用基因工程技術下調CCMs等手段增進微藻對高CO2的耐受力，還可進一步改造細胞的脂質代謝，使過剩的光合固碳產物快速貯存在脂質中，提高微藻生物質作為生物燃料的價值.

總之，盡管對微藻高CO2耐受的研究已有一些進展，對其機制的了解還不夠深入.利用目前快速發展的“組學”工具可望闡明微藻高CO2耐受的機理，并最終為高效利用微藻固碳提供有力的理論支撐.

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