叢枝菌真菌對(duì)小麥的促生長(zhǎng)效應(yīng)與根腐病抑制效應(yīng)

王 立，王 敏，馬 放，李 哲，吳潔婷，安廣楠

(城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(哈爾濱工業(yè)大學(xué))，150090哈爾濱)

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，根腐病［1-2］是影響小麥生產(chǎn)的主要病害類型［3］，主要由播種過(guò)深、營(yíng)養(yǎng)不平衡、凍傷、大水漫灌、調(diào)用帶病的麥種等因素造成［4］.據(jù)統(tǒng)計(jì)根腐病可引起小麥減產(chǎn)達(dá)15%～20%，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，因而對(duì)小麥根腐病的防治一直很受重視［5-6］.目前，針對(duì)小麥根腐病的防治對(duì)策主要以化學(xué)農(nóng)藥拌種為主［7］，但農(nóng)藥殘留超標(biāo)會(huì)引發(fā)食品安全問(wèn)題，且農(nóng)藥施加過(guò)量會(huì)引起嚴(yán)重的面源污染.因此，亟需一種安全、環(huán)保、有效的防治小麥根腐病的方法.

叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)是植物根系與叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)形成的共生體，能夠有效增強(qiáng)作物的物質(zhì)生產(chǎn)和抗病能力［8］，近些年在“綠色肥料”和“綠色農(nóng)藥”開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有巨大潛力［9-11］.叢枝菌根是菌根中分布最廣泛、發(fā)生率最高的一類菌根.已有研究表明，一方面，叢枝菌根真菌侵染條件下能夠有效促進(jìn)宿主對(duì)土壤中礦質(zhì)元素的吸收［12］，增加根際土壤中微生物的數(shù)量，改善植物的碳、氮、磷素營(yíng)養(yǎng)狀況［8］，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，改善作物品質(zhì);另一方面，AM能在宿主植物根際形成大量外生菌絲，大大擴(kuò)展了根系吸收面積，使宿主植物生長(zhǎng)健壯，生命力旺盛，從而增強(qiáng)其抗性［13］.因此，有望在作物病害防治方面發(fā)揮重要作用.本研究選擇叢枝菌根真菌中分布廣泛、可與多種宿主形成良好共生關(guān)系的普適性菌種——摩西球囊霉作為優(yōu)選菌劑，定量分析其在小麥生長(zhǎng)及根腐病防治過(guò)程中可能發(fā)揮的重要作用.

1 試驗(yàn)

1.1 試驗(yàn)材料

在城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室模擬自然人工氣候室中進(jìn)行盆栽試驗(yàn).試驗(yàn)時(shí)間為2013年3月25日～2013年9月28日.氣候條件:室內(nèi)平均氣溫為20.8℃，空氣相對(duì)濕度為(42±0.12)%.

供試菌劑:廣適叢枝菌根真菌——摩西球囊霉(Glomus mosseae)，來(lái)自黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，孢子數(shù)為23個(gè)·g-1.供試基質(zhì):田間滅菌土壤，水解性氮112.24 mg/kg，有 效 磷399.78 mg/kg;pH 為 6.5.

盆栽試驗(yàn):花盆高12 cm，盆口直徑10 cm，盆底直徑8 cm.試驗(yàn)前用75%的酒精溶液浸泡30 min，2 h 后加入相應(yīng)基質(zhì) 0.35 kg.

植物宿主:小麥(Triticumaestivum)，品種為東農(nóng)024，購(gòu)于黑龍江省農(nóng)科院.種子用體積分?jǐn)?shù)為0.1%高錳酸鉀液浸種30 min進(jìn)行表面消毒，然后用蒸餾水浸泡24 h，30℃保濕催芽.待芽長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)，篩選芽長(zhǎng)基本一致的小麥種子10粒均勻地撒在小花盆中，表面覆土約2 cm，每天早晚澆水兩次.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

試驗(yàn)設(shè)置AMF空白基質(zhì)(-GM-AA)、AMF空白基質(zhì)接種根腐病菌(-GM+AA)以及AMF強(qiáng)化基質(zhì)接種根腐病菌(+GM+AA)3個(gè)組別，采用菌劑與土壤基質(zhì)均勻混合的方式，各組基質(zhì)均經(jīng)過(guò)壓力0.15 MPa、溫度121℃條件下蒸氣滅菌2 h.AMF強(qiáng)化基質(zhì)中每盆接種10 g有效菌劑，空白基質(zhì)中添加10 g菌劑的濾紙濾液，用以確保3個(gè)組別除菌根真菌以外微生物群落的一致性.每個(gè)組別設(shè)置10個(gè)重復(fù).所有基質(zhì)灌水至盆底有水溢出，而后移栽小麥幼苗，參考大田種植密度規(guī)劃每盆10株.

1.2.1 AMF 接種及測(cè)定

接種:將種子均勻撒入混合基質(zhì)中，表面覆土約1 cm.

侵染率測(cè)定:采樣時(shí)間為小麥幼苗自然生長(zhǎng)4周后.隨機(jī)選取100條約2 cm長(zhǎng)根尖根段染色［12］、制片、觀察，并根據(jù)十字交叉法計(jì)算菌根侵染率［13-14］.

1.2.2 菌根依賴性計(jì)算

根據(jù)Nemec［15］的分類方法，將植物對(duì)菌根的依賴度分為3級(jí):菌根依賴指數(shù)為300%時(shí)為高強(qiáng)度依賴性，200%時(shí)為中等強(qiáng)度依賴性，100%時(shí)為弱依賴性或無(wú)依賴性.

1.2.3 AMF 對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

分別測(cè)量AMF強(qiáng)化處理組小麥苗的株高、地上及地下生物量、根總表面積，與空白試驗(yàn)組作對(duì)比，研究AMF對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，計(jì)算植物菌根依賴指數(shù).

1.2.4 AMF 對(duì)植物抗/耐病性的影響

根據(jù)植物發(fā)病情況分別計(jì)算植物的發(fā)病率與發(fā)病指數(shù)［16-17］，測(cè)量可溶性蛋白 MDA(丙二醛)、游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及SOD(超氧化物歧化酶)、POD(過(guò)氧化物酶)等體現(xiàn)植物逆性的指標(biāo)，與對(duì)照組(CK)比較，探究AMF對(duì)小麥抵抗根腐病的作用.

根據(jù)劉惕若等［18］對(duì)植物根腐病病情的分類標(biāo)準(zhǔn)，可計(jì)算出植株病情指數(shù)，即

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Ducan多重比較檢驗(yàn)各處理間的差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義水平為5%.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根侵染率和菌根依賴性分析

不施加菌劑的對(duì)照組(CK)中，仍可檢測(cè)出AMF對(duì)小麥根部的侵染，表明自然基質(zhì)中土著AMF普遍能夠與小麥形成共生體，但侵染率很低(3.25%).

相比CK組，施加菌劑可顯著提高AMF對(duì)小麥的侵染作用(P＜0.05).經(jīng)測(cè)定，接種后摩西球囊霉的侵染率可達(dá)42.2%，約為空白基質(zhì)組的14倍.結(jié)果表明，摩西球囊霉對(duì)小麥的侵染效果極佳(P＜ 0.05).

AMF對(duì)小麥的侵染作用可有效提高小麥(地上及地下)對(duì)AMF的菌根依賴性指數(shù).

將不施加菌劑的對(duì)照處理(CK)植物組的菌根依賴指數(shù)設(shè)為100%，相比于CK，施加菌劑摩西球囊霉植物組的菌根依賴性指數(shù)(P＜0.05)為149%，約為未施加菌劑組的1.5倍，說(shuō)明小麥根系對(duì)摩西球囊霉具有較強(qiáng)的依賴性.

為進(jìn)一步揭示菌根真菌對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，將植物生長(zhǎng)對(duì)菌根真菌的依賴性劃分為地上和地下兩部分.與CK相比，施加菌劑可顯著提高植物地上、地下部分的菌根依賴性(P＜0.05).其中，小麥地上、地下部分對(duì)菌劑摩西球囊霉的依賴性分別為123%，166%，均為中等強(qiáng)度依賴［17］.由表1可以看出，小麥地下部分對(duì)菌劑的依賴性明顯高于地上部分.

表1 AMF對(duì)小麥侵染率、菌根依賴性、地上及地下菌根依賴性的影響 %

2.2 AMF對(duì)小麥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

2.2.1 AMF接種對(duì)小麥株高的影響

株高是反應(yīng)小麥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀況最易獲得且最明顯的指標(biāo).分別測(cè)量了小麥生長(zhǎng)第 10天，30天，60天，90天，120天AMF強(qiáng)化基質(zhì)處理組小麥的株高，并與CK對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖1.可以看出，植物株高隨時(shí)間變化呈現(xiàn)先加速而后趨于平緩的二次曲線規(guī)律.其中AMF強(qiáng)化組小麥株高在各個(gè)時(shí)期均顯著高于CK組，具體參數(shù)見(jiàn)表2.

圖1 AMF對(duì)小麥株高的影響

表2 小麥株高－時(shí)間變化動(dòng)態(tài)

從表2擬合方程可以看出:

1)AMF接種植物生長(zhǎng)更旺盛，以曲線的初始斜率表征植物增長(zhǎng)速率，GM組與CK組增長(zhǎng)速率分別為 40.23%、27.29%，提高了約 13%，表明接種植物較非接種植物更早達(dá)到生長(zhǎng)旺盛期.

2)AMF可顯著促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，其最大株高較非接種植物高8 cm(約30%).

3)兩組處理的擬合曲線最高值分別為33.94，25.71，達(dá)到最大值的天數(shù)分別為 72，115 d.增長(zhǎng)速率分別為 40.23%、27.29%，圖 1中陰影部分為菌劑的促進(jìn)效應(yīng).結(jié)果表明，AMF強(qiáng)化組增長(zhǎng)速率更快，最大值遠(yuǎn)大于CK組，且更早達(dá)到最大值，說(shuō)明AMF能夠使小麥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)長(zhǎng)勢(shì)更好，生長(zhǎng)更迅速.

2.2.2 AMF接種對(duì)小麥總生物量及根系總表面積的影響

相比CK組，施加菌劑后可顯著提高小麥的地上、地下生物量(P＜0.05)，對(duì)小麥地上部分的促進(jìn)作用尤為明顯(P＜0.05).施加摩西球囊霉后，植物地上、地下生物量分別提高38.9%、82.3%.說(shuō)明摩西球囊霉菌劑能夠有效促進(jìn)同化物質(zhì)的積累，特別在促進(jìn)根系發(fā)育方面效果顯著，結(jié)果見(jiàn)圖2.

施加摩西球囊霉菌劑后，小麥根部總表面積明顯高于未施加菌劑的CK組(P＜0.05).說(shuō)明自然條件下形成的少量AM菌根結(jié)構(gòu)不能明顯增大根系的營(yíng)養(yǎng)吸收面積，而施加了AMF后根系總表面積比 CK 增大了 40.33%［18］，見(jiàn)圖 3.由于大量菌絲存在增大了小麥根系的總表面積，提高了營(yíng)養(yǎng)吸收效率，保證了小麥旺盛生長(zhǎng)以及良好的抗逆性.

圖2 AMF對(duì)小麥地上、地下生物量的影響

圖3 AMF對(duì)小麥生物量及根系表面積的影響

2.3 AMF對(duì)小麥抗逆性能的提高

可溶性蛋白 MDA(丙二醛)、游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及SOD(超氧化物歧化酶)、POD(過(guò)氧化物酶)等植物生理脅迫指標(biāo)的變化，可以間接反映AMF菌對(duì)植物抗/耐病性的影響，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 AMF對(duì)植物各生理脅迫指標(biāo)的影響

可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、游離PRO質(zhì)量分?jǐn)?shù)、SOD活性、POD活性與植物抗逆性呈正相關(guān)，MDA質(zhì)量摩爾濃度與抗逆性呈負(fù)相關(guān)［19］.由表3可知，與空白基質(zhì)組相比，AMF強(qiáng)化組與抗逆性正相關(guān)的參數(shù)均有明顯提高(P＜0.05)，分別提高 66.9%、50.2%、84.6%、81.8%，MDA 質(zhì)量摩爾濃度明顯下降64.2%(P＜ 0.05)，說(shuō)明 AMF菌劑對(duì)于改善小麥性質(zhì)機(jī)能、增強(qiáng)自身抗病能力具有顯著效果(P＜0.05).

2.4 AMF對(duì)小麥根腐病的增抗效果

圖4分別為添加AMF組(+GM+AA)和未添加AMF組(-GM+AA)小麥根腐病菌侵染小麥根部情況圖.從表觀上可以看出，兩組均出現(xiàn)不同程度的枯黃甚至腐爛，但前者發(fā)病情況明顯輕于后者，說(shuō)明AMF可以保護(hù)植物根部，對(duì)小麥根腐病有一定的增抗效果.

根據(jù)植物發(fā)病情況分別計(jì)算小麥植株的發(fā)病率與發(fā)病指數(shù)［20］，考察菌根作物與非菌根作物抗病能力的差異，結(jié)果見(jiàn)表4.

各實(shí)驗(yàn)組接種根腐病菌后，與CK相比，發(fā)病率及病情指數(shù)均有增加.但施加AMF菌劑組小麥植株的發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)明顯低于空白基質(zhì)組(P＜ 0.05)，分別降低 38%、3.74.

圖4 小麥根部根腐病發(fā)病情況

表4 AMF對(duì)小麥根腐病的增抗效果

3 結(jié) 論

1)小麥能夠與AMF形成菌根共生體AM.人工接種AMF菌劑可顯著提高小麥根部AMF侵染率.摩西球囊霉對(duì)小麥根部侵染率為42.2%，約為自然條件的14倍，其菌根依賴性指數(shù)高達(dá)149%，約為未施加菌劑組的1.5倍，且其地下部分對(duì)菌劑的依賴性明顯高于地上部分.

2)人工施加AMF菌劑，可顯著促進(jìn)小麥的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，其株高、地上及地下生物量、根系總表面積均顯著提高，分別增加 26.67%、38.9%、82.3%、20.33%，這一結(jié)論為菌根技術(shù)用于“綠色肥料”生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ).

3)施加AMF菌劑后，可顯著降低小麥植株的發(fā)病率、發(fā)病指數(shù)以及與植物抗逆性成負(fù)相關(guān)的生理指標(biāo)參數(shù)(P＜0.05)，且大幅度提高與植物抗逆性呈正相關(guān)的生理指標(biāo)參數(shù)(P＜0.05)，對(duì)小麥根腐病具有良好的防治效果，在應(yīng)用于“綠色農(nóng)藥”開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有巨大潛力.

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