苯巴比妥聯合CCl4法建立肝硬化腹水大鼠模型

方 慶，王成業，姚 瑤，王滿媛，許 釩

(1.安徽中醫藥大學，安徽合肥 230012;2.安徽中醫藥大學研究生部，安徽合肥 230038;3.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051)

肝臟是人體代謝的中樞器官，起著調節能量、蛋白質、氨基酸等代謝重要作用。肝硬化是由一種或多種病因長期、反復刺激而引起的慢性肝病，肝硬化早期肝臟處于代償期，而腹水則是肝硬化由代償期向失償期進展的重要標志之一。肝硬化腹水是威脅人類健康的常見疾病，目前尚沒有理想的治療方式。肝硬化腹水動物模型的建立是肝病研究中重要一環，建立理想的肝硬化腹水動物模型不僅是進行此類疾病實驗研究的基礎，也是臨床評價肝硬化腹水診斷和治療方法的有效手段之一［1－5］。

理想的肝硬化動物模型應具備如下條件:與人類肝硬化、門脈高壓的特征相同、造模成功率高、死亡率低、周期短、方法簡便易行、所用造模因素對人體無害或較少危害，環境污染小等。目前，復制肝硬化腹水動物模型的方法主要有:CCl4法、乙醇法、免疫法、膽管結扎法、復合造模法等。無論是單因素法還是復合因素造模法，復制穩定、成功率高的動物模型仍存在一定的難度。

綜合相關文獻［6－7］及前期預實驗對造模方法的摸索，本研究采用苯巴比妥聯合CCl4法復制肝硬化腹水大鼠模型。35%苯巴比妥溶液誘導1周，激活肝臟肝藥酶P450活性，第2周開始，按梯度腹腔注射CCl4油溶液，每周2次至第14周。實驗進行至中后期，收集大鼠24 h尿液，測量尿量;檢查腹腔積液量;肝組織HE染色觀察肝臟病理進程。

1 材料與試劑

1.1 動物 SD大鼠，雄性，SPF級，體重(200±20)g，由江蘇南京青龍山動物繁殖場提供，合格證號:SCXK(蘇)2009－0001。

1.2 試劑 CCl4(分析純):江蘇強盛化工有限公司(批號2008121);福臨門一級菜籽油:中糧東海糧油工業有限公司(批號20111010);甲醛(分析純):上海中試化工總公司(批號20100130);苯巴比妥片:上海信宜藥廠有限公司(國藥準字H31022038);無水乙醚(分析純)，上海中試化工總公司批號(20101010)。

1.3 儀器 MP6001電子天平(上海恒平科學儀器有限公司產品);島津全自動生化分析儀(Olympus，Japan);移液器(Eppendorf);HH.B11.260－TBS臺式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠);TB－718生物組織自動包埋機(湖北孝感市泰維電子有限公司);LEICA RM2135封閉式切片機(湖北孝感市泰維電子有限公司);TK－218Ⅱ恒溫攤片、烤片機(湖北孝感市泰維電子有限公司);DP70數碼照相裝置(Olympus，Japan)。

1.3 溶液的配制

1.3.1 35%苯巴比妥CMC-Na混懸液配制 精密稱取50.0 g CMC-Na粉末，散入盛有蒸餾水的塑料水桶，邊加邊攪拌，加蒸餾水至10 L，室溫放置過夜，即得0.5%CMC-Na混懸液。

精密稱取10片(每片30 mg)苯巴比妥片，得平均片重0.066 56 g。取適量苯巴比妥片，研碎，稱7.765 3 g藥粉。將藥粉加入預先配制的 10 L 0.5%CMC-Na混懸液中，攪拌混勻，即得35%苯巴比妥CMC－Na混懸液。

1.3.2 CCl4油溶液的制備 CCl4油溶液的制備:移液器分別取 CCl41.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL加入菜籽油定容至10 mL即得。

1.4 動物模型的建立 大鼠適應性喂養1周后，除正常組給予蒸餾水作為飲用水外，其他各組大鼠第1周給予35%苯巴比妥CMC-Na混懸液(35 mg/100 mL)作為飲用水誘導1周。第2～3周腹腔注射10%CCl4油溶液，每周2次，劑量為0.1 mL/100 g，首次劑量加倍。第4～5周給予12%CCl4油溶液;第6～7周給予14%CCl4油溶液;第8～9周給予16%CCl4油溶液;第10～11周給予18%CCl4油溶液;第12～14周給予20%CCl4油溶液。從第四周開始，每隔2周，取2～3只動物，對肝臟進行病理檢測，觀察造模過程肝臟病理動態變化。

1.5 成模標準 (1)尿量明顯減少且與正常組相比差異有顯著性;(2)腹腔積液量增高，差異有統計學意義;(3)肝臟肉眼觀察見再生結節，肝臟組織切片觀察匯管區—匯管區或匯管區—中央靜脈纖維間隔互相擴展和連接，分割肝小葉形成假小葉。

1.6 考察指標 (1)24 h尿量:將大鼠置于代謝籠內，適應飼養2 d后，收集大鼠24 h尿液，測量24 h尿量;(2)腹腔積液量:參考文獻方法［8］，于第14周末，大鼠經乙醚麻醉后，沿腹中線剪開3.0 cm，將規格為2.5 cm ×5.0 cm已稱重濾紙迅速塞入腹腔，3 min后濾紙充分吸收腹腔積液，取出，稱濾紙重，以兩次稱量之差計為腹腔積液重量。

1.7 肝組織HE染色 (1)取材:大鼠乙醚麻醉后，打開腹腔，從同葉肝臟剪取一塊大小為2.0 cm×2.0 cm ×0.5 cm的組織;(2)固定:將取下的肝、腎組織分別置10%福爾馬林溶液。脫水透明:將組織依次放入75%乙醇(1.5 h)→ 85%乙醇(1.5 h)→ 95%乙醇(2.5 h)→ 無水乙醇 I(30 min)→ 無水乙醇Ⅱ(30 min)→ 二甲苯I(15 min)→二甲苯Ⅱ(觀察至透明即可);(3)浸蠟包埋:將熔化的石蠟傾入包埋模具中，將組織埋入溶化的石蠟中，包埋模具放置在冷水中加速凝固，待石蠟凝固后，取出包埋蠟塊，修整成規則的正方型或長方型。用石蠟切片機切片，厚度為4～6 μm。(4)脫蠟:載玻片浸入二甲苯I(10 min)→ 二甲苯Ⅱ(10 min)→二甲苯Ⅲ(10 min)→ 無水乙醇(2 min)→95%乙醇(2 min)→80%乙醇(2 min)→ 自來水沖洗;(5)染色:蘇木精浸染(5 min)→ 自來水洗→1%鹽酸乙醇分化數秒 → 自來水洗→PBS藍化(2 min)→自來水洗→伊紅(1 min)→ 自來水洗;(6)脫水、透明:95%乙醇(1 min)→ 100%乙醇 I(1 min)→100%乙醇Ⅱ(3 min)→二甲苯I(5 min)→二甲苯Ⅱ(5 min)→二甲苯Ⅲ(5 min);(7)封片:在載玻片上加1～2滴中性樹膠，加蓋玻片封固，置于通風櫥內室溫干燥。待載玻片晾干后，于光學顯微鏡下觀察并攝相。

1.8 統計學分析 數據采用統計學軟件SPSS 11.0進行分析，結果以“均數+標準差±s)”表示，組間比較采用ANOVA分析。方差齊性，使用LSD法進行比較。P＜0.05為差異具有統計學意義，P＜0.01為差異有顯著性。

2 結果

模型組40只SD大鼠肝硬化模型誘導14周共死亡4只，死亡率10.0%。模型組大鼠24 h尿量較正常組明顯減少;腹腔積液量顯著增多(見表1);病理HE染色結果顯示，模型組肝組織出現大量變性、壞死、形成纖維間隔，正常肝小葉被分割形成假小葉。HE染色表明，模型組大鼠肝硬化模型形成;尿量減少，腹腔積液增多，表明模型大鼠腹水形成，即肝硬化腹水模型復制成功。

表1 大鼠24 h尿量、腹腔積液量± s，n=10)

表1 大鼠24 h尿量、腹腔積液量± s，n=10)

注:與正常組比較1)P ＜ 0.05，2)P ＜ 0.01。

/g正常組組別 24 h尿量/mL 腹腔積液量25.38 ±6.19 0.2544 ±0.0577模型組 16.70 ±4.582) 0.3709 ±0.13481)

3 討論

肝硬化是一種常見的慢性肝病，可由一種或多種原因引起肝臟損害，組織學上表現為肝細胞彌漫性變性壞死，繼而出現纖維組織增生和肝細胞結節狀再生，這三種改變反復交錯進行，結果肝小葉結構和血液循環途徑逐漸被改建，使肝變形變硬而導致肝硬化，肝硬化腹水是其失償代謝期常見臨床表現之一，建立適合的肝硬化動物模型，是進行實驗研究的基礎。

苯巴比妥是典型的肝藥酶誘導劑，通過誘導肝藥酶P450等藥物代謝酶，提高肝臟的物質代謝功能，可加促外源性物質如藥物和內源性物質如NH3的生物轉化。

CCl4是廣泛用于建立肝硬化動物模型的化學誘導劑，其特點為成模率高，重復性好，方法較為簡單。其作用機制為CCl4經肝門靜脈進入肝臟，隨血液循環自匯管區流向中央靜脈區。在這此過程中，肝細胞吸收CCl4，肝細胞微粒體細胞色素氧化酶P450被激活生成大量活性三氯甲基(CCl3－)，該自由基通過攻擊肝細胞膜的磷脂，導致脂質過氧化，進而破壞細胞膜的結構。另外，CCl3－還可與蛋白質發生共價結合，損傷線粒體，導致肝內還原性輔酶A(NADH)和三磷酸腺苷(ATP)的合成減少，進而抑制脂肪酸氧化和三羧酸循環［9］。此外，內質網受到損傷可導致脂蛋白合成發生障礙，使得三酰甘油和脂肪酸在肝細胞內大量蓄積，造成脂肪變性、甚至凋亡。因此，采用低濃度CCl4反復刺激機體，可使肝組織經“損傷—修復—損傷”的循環作用，從而造成肝臟的炎癥遷延，不斷形成纖維化，最終導致肝硬化的發生。通常，CCl4油溶液經皮下注射，3～5 mL·kg－1，每周 2次，12～15周即可成模。CCl4誘導肝硬化模型，機制明確、效果肯定、重現性好、劑量可控，多見于模擬突發性肝功能衰竭、肝細胞脂肪變性導致的肝硬化。然而單純的CCl4刺激，會導致高死亡率，甚至多器官毒副反應，從而限制了其在肝纖維化及肝硬化病理發生機制研究中的應用。本研究發現造模期間大鼠死亡率與其體重有一定的關系:1周內體重下降達20 g以上的大鼠腹腔注射CCl4容易死亡且腸系膜出現黏連，因此試驗期間，每周定期稱量體重，若出現體重急劇下降即立即停止注射造模劑，待動物狀態恢復后再繼續造模。這樣可以大大降低造模期間動物的死亡率，從而達到提高造模的成功率。

本實驗采用苯巴比妥聯合CCl4法復制肝硬化腹水模型。苯巴比妥為肝藥酶誘導劑，能促進肝細胞色素P450的合成，加速CCl4的在體內代謝從而加重肝毒性，縮短了單純使用CCl4誘導肝硬化腹水的時間。實驗中CCl4油溶液濃度呈梯度遞增，一方面降低了造模過程的死亡率，同時可對肝臟造成漸進性的刺激，逐步加重肝損傷，使肝臟病理逐漸進入肝硬化。

從苯巴比妥聯合CCl4法復制肝硬化腹水大鼠模型的方法的相關指標來看，模型組大鼠肝臟病理檢查見假小葉形成，提示肝臟病變進入肝硬化階段;尿量明顯減少，腹腔積液量顯著增加，表明腹水形成，即肝硬化腹水模型形成。

［1］王金娥，姜慧杰.制備不同種類肝纖維化及肝硬化動物模型研究進展［J］.實用肝臟病雜志，2011，14(1):68 －71.

［2］郭若涵，白 彬.大型動物實驗性肝纖維化及肝硬化模型的研究進展［J］.世界華人消化雜志，2014，21(5):421 －426.

［3］馮英巧，楊元生，崔淑蘭.肝纖維化實驗動物模型造模方法及應用研究進展［J］.廣東藥學院學報，2013，29(5):570 －574.

［4］馬 歡，王邦茂.原發性膽汁性肝硬化動物模型研究進展［J］.國際消化病雜志，2012，32(2):93 －95.

［5］徐安書，文正榮，孫志為.肝硬化實驗動物模型的研究現狀［J］.醫學綜述，2010，16(7):1046 －1048.

［6］張云巍，胡亞卓，徐麗娟，等.四氯化碳法制備肝硬化大鼠模型中重要臟器的病理改變［J］.世界華人消化雜志，2014，22(1):74－79.

［7］宣 佶，田耀洲，曹 鵬，等.膽汁淤積性肝硬化大鼠模型的改良［J］.中國比較醫學雜志，2014，24(4):57 －61.

［8］Domenicali M，Caracen P，Giannone F，et al.A novel model of CCl4induced cirrhosis with ascites in the mouse［J］.Journal of Hepatology，2009，(51):991 －999.

［9］冀潤利，趙青娥.水飛薊素對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護作用［J］.中國應用生理學雜志，2012，28(3):279 －281.