廣西壯族及漢族人群CD40配體基因rs7050168G/A遺傳多態性

吳成將陳健明藍艷羅宏成向陽王春芳韋葉生★

廣西壯族及漢族人群CD40配體基因rs7050168G/A遺傳多態性

吳成將1陳健明1藍艷2羅宏成1向陽1王春芳1韋葉生1★

目的 研究CD40配體基因rs7050168G/A位點多態性在廣西壯族及漢族人群中的分布，同時比較其在不同種族人群間以及同一種族不同性別之間，基因型和等位基因頻率分布的差異。

方法采用單堿基延伸PCR（PCR-SBE）的方法，分析201名廣西漢族人和199名廣西壯族人的CD40配體基因rs7050168G/A多態性。 結果 CD40配體基因rs7050168G/A位點表現出AA、AG和GG三種基因型，其在壯族人中的頻率分別為97.0%、1.5%和1.5%，而在漢族人中頻率分別為98.0%、1.0%和1.0%。CD40配體基因多態性在在廣西壯族和漢族人群之間比較差異都沒有顯著性（P均＞0.05）。進一步將廣西漢族人群分型數據同人類基因組計劃公布的4個人群相比，我們發現在廣西漢族人群中CD40配體基因rs7050168G/A位點基因型和等位基因頻率與日本和北京人群比較，差異均具有顯著性 （P均＜0.05），但與歐洲和非洲人群比較，差異沒有顯著性（P均＞0.05）。 結論 在廣西地區壯族及漢族人群中存在著CD40配體基因多態性，其基因多態性的分布頻率沒有顯著性的差異，但與其他種族人群比較存在著顯著差異。這種差異可能是導致一部分疾病在不同種族人群之間的臨床表現以及發病率存在顯著不同的因素之一。

CD40；基因多態性；種族

［ABSTRACT］Objective To study gene polymorphism at rs7050168G/A of CD40 ligand in Guangxi Zhuang and Han populations，and to compare distributions of allele and genotype frequencies among different races and different gender in the same race.Methods The frequency of CD40 ligand gene rs7050168G/A allele and genotype were detected by using the method of polymerase chain reaction-single base extension （PCR-SBE）in 201 Guangxi Han and 199 Guangxi Zhuang populations.Results The genotype frequencies of AA，AG and GG of rs7050168G/A was 97.0%，1.5%and 1.5%in the Zhuangs，and 98.0%，1.0%and 1.0%in the Hans respectively.The frequencies of allele and genotype distribution of CD40 ligand geners7050168G/A polymorphism were not significant difference between the Zhuangs and the Hans （P＞0.05）.There were significant difference as compared with HapMap-JPT and HapMap-HCB （both P＜0.05），but compared with HapMap-CEU and HapMap-YRI，the CD40L polymorphism were not significantly difference （P＞0.05）.Conclusion There are CD40 ligand gene polymorphism in Guangxi Zhuang and Han populations.The frequencies of polymorphism distribution of CD40 ligand gene were not significant difference between the Zhuang and Han populations， whose distributions are significantly difference compared with others ethnic populations.The variation of CD40 ligand gene polymorphism among different ethnic groups might account for the varied clinical spectrum of some CD40 ligand related diseases.

［KEY WORDS］CD40 ligand；Polymorphism；Ethnic

CD40配體即CD40L，是TNF超家族的主要成員之一，表達于CD4+T細胞、柱狀細胞、血管內皮細胞、單核細胞、自然殺傷細胞和血小板上，是一種分子量為39KD的Ⅱ型跨膜糖蛋白。CD40配體是體液和細胞免疫的中樞分子，與其受體CD40相互作用，作為T、B細胞活化的第二信號，介導T細胞依賴的B細胞活化和效應T細胞產生，在體液免疫和細胞免疫調節中發揮著重要的作用。人CD40配體基因定位于 X染色體的 q26.3-q27.1區，由5個外顯子和4個內含子組成。分子生物學研究表明，CD40配體基因存在著單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP），這種基因多態性與人類類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化、腎移植排斥反應及多發性硬化癥的關系，已成為國內外專家學者研究的熱點［1-5］。因此本研究采用單堿基延伸的PCR技術和基因測序法來研究廣西地區壯族及漢族兩個種族人群的CD40配體基因單核苷酸多態性，并將其分型數據與人類基因組計劃已經公布的4組人群（歐洲人、非洲人、日本人和中國北京人）進行比較，以探討基因多態性在不同種族正常人群中的分布差異為與CD40配體相關的疾病和遺傳等方面的研究提供一些基礎性的參考資料。

1 對象與方法

1.1 對象

隨機選取了來自廣西各地區在我院體檢健康且相互之間無血緣關系的400人。其中選取了廣西漢族男性109人，女性92人，共201人，年齡均在22～84歲；廣西壯族男性116人，女性83人，共199人，年齡均在25～83歲。所有對象的臨床和實驗室指標均在正常范圍內。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

用EDTA-K2抗凝管采集以上人群靜脈血3 mL，全血基因組DNA提取，參照已建立的改良碘化鈉法［6］。

1.2.2 引物設計與合成

根據CD40配體基因rs7050168G/A位點多態性和已知的DNA序列，用在線Primer3軟件（http：//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3www.cgi）設計PCR引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。用于特異性擴增 CD40配體基因包含rs7050168G/A位點堿基的DNA片段的引物，上游引物序列為：5′-CTTTTCCCCTGGGACCCAATT T-3′；下游引物序列為：5′-AATACCCCATGAGG CCCATTTC-3′；延伸引物為：5′-TTCCTCCTTT TGTCCCTCTAAGTCCCA-3′。

1.2.3 PCR擴增

CD40配體的PCR擴增反應體系為20 μL，其中包含了 10×PCR緩沖液2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，上游引物、下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足體積均用滅菌雙蒸水補足至20 μL。PCR產物用Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR來獲得，PCR產物通過蝦堿酶（SAP）（from Promega）和外切酶I（EXO I）（from Epicentre）經過純化后，用ABI公司的 SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應。延伸產物采用蝦堿酶（SAP）（from Promega）純化后在 ABI3130XL上樣。SNP分型采用GeneMapper4.0（Appliedbiosystems）來分析。

1.3 統計分析

CD40配體基因型和等位基因頻率均采用基因直接計數法計算，各組間基因型和等位基因頻率比較均采用χ2檢驗，用SPSS 11.5軟件包進行分析，P＜0.05認為具有統計學上的意義。

2 結果

2.1 CD40配體基因型檢測結果

CD40配體基因 rs7050168G/A多態性，PCR擴增產物片段大小為297bp。經ABI3130XL基因檢測儀SNP分型，其結果顯示出rs7050168G/A位點檢測到了AA、AG和GG三種基因型。基因測序進一步驗證了我們的分型結果 （圖 1）。

圖1 CD40配體基因rs7050168G/A測序圖

2.2 CD40配體基因多態性在廣西壯族和廣西漢族人群中分布頻率的比較

根據人類基因組CD40配體基因SNP的數據庫資料，我們選擇rs7050168G/A位點進行多態性的分析。這個多態性位點的基因型和等位基因頻率在男女之間比較，差異都沒有顯著性 （P均 ＞0.05）。同時這個多態性位點的基因型分布和等位基因頻率在廣西壯族和漢族人群之間比較，差異同樣沒有顯著性（P＞0.05），見表1。

表1 廣西壯族和漢族人群CD40配體基因rs7050168G/A基因型和等位基因分布頻率的比較Table 1 Comparisons of distribution of genotype and allele frequencies of CD40 ligand gene rs7050168G/A in Guangxi Zhuang and Han populations

2.3 CD40配體基因多態性在不同種族人群間的比較

將廣西漢族人群CD40配體基因多態性分布頻率分別與人類基因組計劃公布（Hapmap）的4個種族人群比較，結果顯示CD40配體基因的基因型和等位基因頻率同日本和北京人群相比，差異都有顯著性 （P均＜0.05），但同歐洲及非洲人群相比，差異都沒有顯著性（P均＞0.05）。此外，我們將CD40配體基因rs7050168G/A多態性位點的基因型及等位基因頻率在非洲人群和廣西壯族人群間比較，發現等位基因頻率存在著統計學差異 （P＜0.05），見表2。

表2 不同種族及地區人群CD40配體基因rs7050168G/A多態性分布頻率的比較Table 2 Comparisons of frequency of CD40 ligand gene rs7050168G/A polymorphism among different ethic and regional groups

3 討論

在人類基因組中，基因多態性是一種常見的現象，其在闡明人體對疾病、毒物的易感性與耐受性，疾病臨床表現的多樣性，以及對藥物治療的反應性上都起著重要的作用。而在研究某些疾病基因的多態性分布時，首先了解其在不同種族正常人群中的分布情況，是正確分析疾病與基因多態性之間關系的基礎。廣西是一個多民族聚居的區域，有48個以上民族長期共存，其中有12個世居民族。通過對這些不同民族基因多態性的研究，有助于發現基因多態性在不同種族人群中的分布規律。因此，本文將CD40配體基因多態性在廣西漢族和廣西壯族人群中進行對比研究，從而為探索一些疾病在不同種族間的遺傳規律，提供一些前瞻性的基礎資料。

CD40配體也稱gp39或CD40L，為腫瘤壞死因子超家族成員，主要存在于活化的CD4+T淋巴細胞表面，提供B淋巴細胞活化所必需的協同刺激信號， 在巨核細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、外周血嗜堿性粒細胞、平滑肌細胞、B細胞、和單核細胞的表面也有少量表達。大量研究發現，CD40配體是一個重要的致病因子，通過與其受體CD40特異性結合而在許多疾病形成和發展過程中發揮著關鍵的作用，如通過誘導干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6、IL-8等細胞粘附分子在活化的平滑肌細胞和內皮細胞上的表達而啟動動脈粥樣硬化；此外也參與移植排斥反應、內皮損傷、血小板活化、血栓形成、血管形成、腦損傷等病理過程［7-9］。CD40配體基因位于X染色體的q26.3-q27.1包含5個外顯子和4個內含子，CD40配體基因存在著單核苷酸多態性（SNP），這種基因多態性可能影響到CD40配體基因的功能，進而可能影響到CD40配體基因多態性與相關疾病的發生發展。Bilińska等［10］研究發現 CD40配體基因多態性影響著多發性硬化癥等自身性疾病的發生和發展；Zhao［11］和王新等［12］研究表明CD40配體基因多態性與冠狀動脈病變程度密切相關。

利用單堿基延伸PCR技術（PCR-SBE），我們對來自廣西地區的壯族和漢族人群中CD40配體基因 rs7050168G/A多態性位點進行檢測。將rs7050168G/A多態性位點的基因型和等位基因頻率在廣西壯族和漢族之間以及男女性別之間進行比較，結果表明差異均無顯著性（P均＞0.05）。進一步研究發現廣西漢族人群的rs7050168G/A多態性位點的基因型和等位基因頻率與日本和北京人群比較，差異都具有顯著性（P均＜0.05），但同歐洲和非洲人群比較，差異沒有相關性 （P均＞0.05）。此外CD40配體基因rs7050168G/A多態性位點的等位基因頻率在非洲人群和廣西壯族人群之間也存在著顯著差異（P＜0.05），造成此結果的可能原因是由于生存環境、飲食習慣、生活方式等的不同引起。從本文結果可以看出，CD40配體基因型分布和等位基因頻率在不同種族間存在著明顯的差異。

總之，對中國廣西壯族和漢族人群CD40配體基因多態性的研究，不僅為CD40配體基因多態性與臨床疾病相關性的研究分析提供了前瞻性的基礎資料，而且也為進一步的人類學及群體遺傳學的研究和基因多態性普查奠定了基礎。

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The genetic polymorphism of rs7050168G/A CD40 ligand gene in Guangxi Zhuang and Han populations

WU Chengjiang1，CHEN Jianming1，LAN Yan2，LUO Hongcheng1，XIANG Yang1，WANG Chunfang1，WEI Yesheng1★
（1.Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise，Guangxi，China，533000；2.Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise，Guangxi，China，533000）

國家自然科學基金（81260234）；廣西自然科學基金（2011GXNSFA018198）；廣西衛生廳重點科研課題 （重2012086）

1.右江民族醫學院附屬醫院檢驗科，廣西，百色 533000 2.右江民族醫學院附屬醫院皮膚科，廣西，百色 533000

韋葉生，E-mail：wysh22@163.com