線鱗型黃金鯽（框鱗鏡鯉♀×紅鯽♂）mtDNA及同工酶的遺傳分析

楊晶晶等

摘要：對全鱗型黃金鯽和線鱗型黃金鯽的mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段進行PCR擴增并測序，并檢測了兩種類型黃金鯽肌肉的GPI和LDH同工酶。1尾黃金鯽（全鱗型）獲得了堿基排列順序清晰的1348 bp的片段，2尾黃金鯽（全鱗型）尾為1351 bp，3尾黃金鯽（均為線鱗型）為1349 bp。應用MEGA6.0軟件與GenBank上的3個鯉魚（KC292935、KC292936和X61010.1）和3個鯽魚（KC292946、KC292947和KC292948）相應區(qū)段比較結(jié)果表明，6尾黃金鯽與鯉魚和鯽魚的遺傳距分別為0.011和0.095，鯉魚與鯽魚的遺傳距為0.097。GPI與LDH兩種同工酶譜顯示兩種類型黃金鯽均具有來自鯉鯽雙方的遺傳物質(zhì)。結(jié)果表明，全鱗型與線鱗型黃金鯽均符合母本為鯉魚、父本為鯽魚的遺傳特征，推測線鱗型黃金鯽母本鱗被的基因型應為SSNn、SsNn或ssNn，父本應為SSnn，線鱗型黃金鯽鱗被的基因型應為SSNn或SsNn。

關(guān)鍵詞：黃金鯽；鱗被；基因型；mtDNA；堿基序列；同工酶

黃金鯽為國家級天津市換新水產(chǎn)良種場培育的以框鱗鏡鯉為母本、紅鯽為父本的雜交種，2007年被國家認定為養(yǎng)殖新品種（品種登記號：GS02-001-2007）。魚體背部及兩側(cè)呈淺黃色，腹部銀灰色，體被全鱗，鱗片中等大小，側(cè)線鱗31～34枚[1-2]。2013年11月份在天津市兩個養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的黃金鯽中發(fā)現(xiàn)有線鱗型個體（90尾中有6尾線鱗型個體，占6.67%）。

鯉魚中依據(jù)鱗被特征可以分為鱗鯉（scaled carp）、線鱗鏡鯉（linear mirror carp）、散鱗鏡鯉（scattered mirror carp）和革鯉（leather carp）或裸鯉（nude carp）共四種類型，其中線鱗鏡鯉和裸鯉均含有N基因，而樓允東認為在我國用于雜交的鯉魚品種不包括線鱗鏡鯉和革鯉[3-4]。至今在我國鯉鯽雜交子代中沒有關(guān)于線鱗型個體的報導。mtDNA為母性遺傳，其D-loop以及COⅠ等區(qū)段的序列分析可以作為種類鑒別的DNA條形碼[5-10]。同工酶可以有效鑒別鯉鯽雜交種[11-14]。

為探討線鱗型個體是否屬于黃金鯽，是否具有黃金鯽的遺傳結(jié)構(gòu)，鱗被遺傳特點如何，本研究以3尾全鱗型黃金鯽以及3尾線鱗型個體（以下也稱為黃金鯽）為實驗材料進行了mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段的PCR擴增和序列測定，與GenBank上的鯉魚、鯽魚的相應區(qū)段進行了序列比較。同時檢測了兩種類型黃金鯽肌肉的GPI和LDH同工酶。以期為黃金鯽的種質(zhì)鑒定以及鯉、鯽魚遺傳育種工作提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗魚

于2013年11月從天津市某魚類養(yǎng)殖場采集3尾全鱗型黃金鯽以及3尾線鱗型黃金鯽（圖1、表1）。鮮活狀態(tài)下剪取大小約1.0 cm×0.5 cm的鰭條用于DNA提取，-20 ℃冷凍保存魚體用于同工酶的檢測。

1.2DNA的提取、mtDNA D-loop及鄰近區(qū)段PCR擴增

用苯酚-氯仿抽提法從鰭條提取總基因組DNA，4 ℃下保存?zhèn)溆肹15]。以提取的DNA為模板，使用L15923和H1067引物對每尾試驗魚的mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段進行擴增，兩個引物的結(jié)合位點分別位于tRNAThr和12S rRNA 編碼區(qū)上。將PCR產(chǎn)物委托深圳華大基因科技有限公司純化并測序，得到的序列依據(jù)峰圖進行確認[9]。

1.3DNA序列分析

使用MEGA6.0軟件對6個黃金鯽序列、GenBank上的3個鯉魚序列（KC292935、KC292936和X61010.1）和3個鯽魚序列（KC292946、KC292947和KC292948）進行比對分析，計算6尾黃金鯽與鯉魚、鯽魚的遺傳距，構(gòu)建NJ樹[16]。

1.4同工酶電泳

使用水平式淀粉凝膠電泳法（緩沖液為C-APM）檢測試驗魚背部肌肉的葡萄糖磷酸異構(gòu)酶（GPI）和乳酸脫氫酶（LDH），并與鯉、鯽對照。電泳及染色同鮑迪等采用的方法[14]。

2結(jié)果

2.1mtDNA D-loop 及其鄰近區(qū)段的PCR擴增

對6尾黃金鯽的mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段進行PCR擴增，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳均得到長度大約為1600bp的DNA片段（圖2）。

2.2黃金鯽序列與GenBank中的鯉魚序列（KC292936）的比較

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、測序、峰圖確認，獲得了堿基排列順序清晰的1348bp-1351 bp 的片段。與GenBank中的鯉魚序列（KC292936）進行BLAST比對，有堿基插入現(xiàn)象，所得片段位于KC292936中的100至1447之間，包含部分tRNAThr、全部D-loop和部分tRNAPhe。6尾黃金鯽中1號和3號為1種單倍型、片段長度為1351bp，2號為1種單倍型、片段長度為1348bp，4號、5號和6號為1種單倍型、片段長度為1349bp（表2）。

2.3黃金鯽與鯉、鯽的遺傳距離和系統(tǒng)樹

使用MEGA6.0對6尾黃金鯽和GenBank上的3個鯉魚序列和3個鯽魚序列進行分析。6尾黃金鯽個體間、鯉魚3個序列間和鯽魚3個序列間的遺傳距分別為0.006、0.018和0.001。3尾全鱗型黃金鯽與3尾線鱗型黃金鯽、鯉及鯽的遺傳距分別為0.009、0.012和0.094，3尾線鱗型黃金鯽與鯉、鯽的遺傳距分別為0.010和0.096，鯉、鯽之間的遺傳距為0.097。12個序列間的NJ樹見圖3。

2.4同工酶

同工酶電泳分析結(jié)果表明全鱗型、線鱗型的GPI和LDH兩種同工酶均由來自于鯉、鯽雙方的遺傳物質(zhì)所支配（圖4）。

3討論

3.1線鱗型黃金鯽父母本的推測

線粒體DNA（mtDNA）為母性遺傳，其一些區(qū)段的RFLP或堿基序列可以用于物種的遺傳多樣性分析，也可以作為DNA條形碼進行物種鑒定[4-11]。本研究中得到的包含部分tRNAThr、全部D-loop和部分tRNAPhe 的DNA片段，3尾全鱗型黃金鯽與3尾線鱗型黃金鯽之間的遺傳距為0.009，3尾全鱗型黃金鯽和3尾線鱗型黃金鯽與GenBank中3個鯉魚序列的遺傳距分別為0.012和0.010，均小于2%，符合種內(nèi)遺傳特征[7-8，10]。由此可以認為無論是全鱗型黃金鯽還是線鱗型黃金鯽，其母本均為鯉魚。同工酶是雜交種鑒別的有效手段之一[11-14]。全鱗型黃金鯽和線鱗型黃金鯽的葡萄糖磷酸變位酶（GPI）和乳酸脫氫酶（LDH）均具有鯉鯽雙方的遺傳物質(zhì)，符合鯉鯽雜交種的特性[11-12，14]。

3.2線鱗型黃金鯽鱗被基因型的推測

鯉魚鱗被是由S-s和N-n兩對基因控制，可分為四種類型，分別為鱗鯉（全鱗）（S-nn）、線鱗鏡鯉（S-Nn）、散鱗鏡鯉（ssnn）和革鯉（ssNn），NN個體不能存活[3-4]。歐鯽、丁鱥和鯉魚具有位于同源染色體上的同源基因，歐鯽與革鯉的雜交的子代中幾乎一半是全鱗型、一半是線鱗型，線鱗型鯉鯽雜種外形頗似線鱗鏡鯉[3]。由于鯉魚中NN個體不能存活，所以推測本研究中線鱗型黃金鯽母本鱗被的基因型應為SSNn、SsNn或ssNn，這樣的母本與紅鯽雜交，理論上一半子代應為全鱗型個體（SSnn或Ssnn）、另一半應為線鱗型個體（SSNn或SsNn）。

參考文獻：

[1]金萬昆.淡水魚類遠緣雜交實驗報告[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社，2009：127-140

[2] 金萬昆，付連君.黃金鯽養(yǎng)殖技術(shù)[J].河南水產(chǎn)，2010（4）：24-25

[3] 張興忠，仇潛如，陳曾龍，等.魚類遺傳與魚種[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1988：93-99

[4] 樓允東.魚類育種學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999：305-313

[5] 肖武漢，張亞平.魚類線粒體DNA的遺傳與進化[J].水生生物學報，2000，24（4）：384-391

[6] 周延清，楊清香，張改娜.生物遺傳標記與應用[M].北京：化學工業(yè)出版社，2008：119-132

[7] Hebert P D N，Ratnasingham S，deWaard J R.Barcoding animal life： cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].Proceedings of the Royal Society B，2003，270：96-99

[8] Hebert P D N，Cywinska A，Ball S L， et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proceedings of the Royal Society B，2003，270：313-321

[9] 郝君，楊薔，鮑迪，等.6種魚mtDNA D-loop及其鄰近區(qū)段的序列比較分析[J].大連海洋大學學報，2013，28（2）：160-165

[10] 張大莉，董仕，白俊杰，等.大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種mtDNACOⅠ序列的分析[J].大連海洋大學學報，2014，29（3）：212-216

[11] Dong S， Taniguchi N.Allozyme， morphology and growth autotriploids and allotriploids in common carp[J].Suisanzoshoku，1993，41（1）：35-43

[12] 董仕，王茜，孟憲軍.湘云鯽紅細胞大小及同工酶分析[C].2001年中國水產(chǎn)學會學術(shù)年會論文集（中國水產(chǎn)學會編），北京：海洋出版社，2002：61-65

[13]丁立云，曹義虎，賀剛，等.同工酶分析技術(shù)及其在水產(chǎn)動物研究中的應用[J].江西水產(chǎn)科技，2013（3）：31-35

[14] 鮑迪，梁愛軍，董瑩，等.鯉鯽雜交子代的同工酶分析[J].水產(chǎn)科學，2012，31（5）：283-287.

[15] Perez-Enriquze R，Taniguchi N.Genetic structure of red sea bream（Pagrus major） population of Japan and the Southwest Pacific，using Microsatellite DNA Markers[J].Fisheries Science，1999，65（1）：23-30

[16] Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al.MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J].Molecular Biology and Evolution，2013，30（12） ：2725-2729

（收稿日期：2015-05-26）